木蝴蝶提取物槲皮素的含量测定及药动学研究

木蝴蝶提取物槲皮素的含量测定及药动学研究

木槿花是紫嫣科木槿花的成熟种子。作为一种常见的中药，它被记录在《云南南部草本植物》中，有数百年的药物历史。在2010年的《中华人民共和国法典》中。中医理论认为,木蝴蝶性味苦、甘、凉,具有清肺利咽止咳、疏肝和胃及生肌之功效,主治上呼吸道感染、急性支气管炎、慢性咽炎、肺炎后期等症。现代医学研究表明:木蝴蝶具有镇痛、抗炎、抗菌、抗氧化、抑制病毒及肿瘤生长等多种药理作用。药物代谢动力学研究作为药物化学和药理作用之间的桥梁,有助于进一步揭示黄酮类化合物有效成分发挥药效的作用机制[6,7,8,9,10,11,12,13]。本文尝试采用高效液相色谱检测方式建立高灵敏度并且操作简单的木蝴蝶中槲皮素成分的体内分析方法,能够适用于低剂量灌胃后木蝴蝶黄酮在大鼠体内的药代动力学研究。1仪器和检测方法Agilent1200型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);AgilentEclipseXDB-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);Agilent1200系列四元泵,DAD1260型检测器;UV-2540型分光光度计(日本岛津公司);AE200型电子天平(METTLERTOLEDO公司);SB-5200DTDN型超声波清洗仪(昆山超声仪器公司)。木蝴蝶提取物由南华大学药理研究中心天然药化室提取制备,总黄酮含量(g/g)为38.5%,其中槲皮素的含量为19.8%,提取物批号130725,对照品槲皮素(批号:100081-200907)购自中国药品生物制品检定所,葡萄糖醛酸苷水解酶(批号:015k3795,Sigma公司)。甲醇、乙腈为色谱纯,水为双蒸水,其他试剂均为分析纯。实验动物:SD大鼠10只,雌雄各半,体重为(200±20)g,南华大学动物实验研究中心,动物合格证号:SYXK(湘)2010-0004。2方法2.1冰醋酸溶液b相AgilentEclipseXDB-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相:乙腈(A相)-0.1%冰醋酸(B相)水溶液,进行梯度洗脱(0~0.01min,A相为12%;0.01~5min,A相为15%;5~15min,A相为22%;15~25min,A相为35%;25~35min,A相为40%),流速:1.00mL/min,柱温:30℃,经全波长扫描确定检测波长为278nm,进样量10μL。2.2木继续给药、水处理10只大鼠随机分为2组,分为正常对照组和给药实验组,每组5只,实验前禁食12h,自由饮水。实验组灌胃给药10mg/kg木蝴蝶提取物,正常组给予等体积的生理盐水。给药前(0min)和给药后10、20、30、60、90、120、180、240、360、480min经大鼠眼眶取血约0.5mL,置肝素化离心管中,相对离心力为2500g,离心15min,精密吸取上层血浆200μL,混匀后置-20℃冰箱保存待测。2.3丙酮溶液的制备37℃水浴解冻样品后,加入980U/mL葡萄糖醛酸苷水解酶80μL,37℃振荡水浴下水解30min加入丙酮600μL终止反应。涡旋2min后,相对离心力为6700g,离心10min。取上清液850μL,50℃下氮气吹干,加入流动相85μL溶解,相对离心力为10000g,离心10min。取上清液进样分析。3结果3.1方法学评价3.1.1血浆对照品和血浆生物样品的制备取正常组大鼠血浆按“2.3”项下方法处理后进样分析,得到空白血浆色谱图见图1-A;另取一份空白血浆,加入槲皮素对照品,溶于流动相后进样分析,得到血浆对照品的图谱见图1-B;抽取给药10mg/kg后10min的血浆生物样品1份。按“2.3项”下方法处理后进样分析,得到生物样品图见图1-C;由图可见在本文分析法下,空白血浆的内源性物质不干扰槲皮素的测定,且给药后生物样品和对照品在相同位置出峰,说明该方法对大鼠血浆中槲皮素的分析有专属性。3.1.2对照品血浆的制备精密称取槲皮素1.0mg以甲醇定容至10mL作为对照品贮备液。以流动相稀释储备液100倍,配置1.0μg/mL的对照品溶液。在450μL空白大鼠血浆中精密加入对照品溶液50μL,再以空白血浆逐级稀释,配制成0.5、1.0、5.0、10.0、50.0μg/mL系列浓度的对照品血浆。按照“2.3”项下方法处理后进样分析。以峰面积Y为纵坐标,对照品浓度X为横坐标,计算得到槲皮素回归方程分别为:Y=13.86X+0.9663,r=0.9969。3.1.3对照品血浆放置不同高度的时,进样测定峰面积以空白血浆配制槲皮素对照品血浆,配置后立即按“2.3”项下方法处理,进样测定峰面积,以0h的峰面积A0;对照品血浆配制后,于室温下放置2h再按照“2.3”项下方法处理,进样测定峰面积A1;将对照品血浆按“2.3”项下方法处理后在室温下放置24h,进样测定峰面积A2;对照品血浆放置-20℃冰箱3d后按“2.3”项下方法处理,进样测定峰面积A3。结果A1、A2、A3分别与A0比较,偏差均在15%以内。3.1.4对照品血浆的制备在标准曲线范围内选择低、中、高三个浓度(7.5、15.0、25.0μg/mL),以空白血浆配置成相应对照品血浆,每个浓度5份;同时配制相同浓度的以流动相为基质的对照品溶液。对照品血浆在经考察的样品稳定期内,按照“2.3”项下方法处理后进样测定,对照品溶液直接进样分析。对照品血浆测定值和对照品溶液测定值之比为提取回收率。结果见表1。3.1.5g/ls-lg/mol选择低、中、高三个浓度(7.5、15.0、25.0μg/mL)。以空白大鼠血浆配制成相应对照品血浆,每个浓度5份,按照“2.3”项下方法处理后进样分析,计算浓度,求得本法的准确度和精密度,结果见表1。3.2时间-浓度曲线按“2.2”项下方法采集大鼠灌胃给予木蝴蝶提取物10mg/kg后不同时间的血浆样品,按“2.3”项下方法处理后进样分析,测定0~24h各时间点槲皮素的血药浓度,绘制时间-浓度曲线如图2。根据血药浓度-时间曲线,采用非房室模型经DAS2.0实用药动学软件计算,得到木蝴蝶提取物10mg/kg灌胃给药后槲皮素的药代动力学参数见表2。4木聚糖酯类化合物ld50本实验研究表明,大鼠灌胃给予木蝴蝶提取物后药物吸收迅速,在30min前达到最大血药浓度,AUC以及Cmax随着给药剂量的增加而呈