壁虎药材多糖提取工艺研究

壁虎药材多糖提取工艺研究

壁虎又名甲宫、天顺，是壁虎科动物无鳍壁虎的所有成员。其味咸,性寒,有小毒。归肝经。具有祛风定惊,解毒散结的功效,可用于历节风痛,四肢不遂,惊痫,破伤风,痈疮,瘰疬,疠风,风癣,噎膈等症的治疗。壁虎含有多糖、组织胺类、蛋白质、微量元素、维生素、脂肪、核苷等多种化学成分,吴雄志等从壁虎中分离得到硫酸守宫多糖,体外实验表明该成分具有抑制肿瘤细胞的作用。壁虎目前未载入中国药典,也没有部颁的质量评价标准。本研究首次采用超声法提取壁虎药材中的多糖,通过正交试验设计筛选出优化的多糖提取方案,以期为中药壁虎质量标准的制订与资源开发利用提供科学的实验依据。1设备和材料1.1超声、电子天平LGR16-W高速冷冻离心机(北京医用离心机厂)、超声波清洗器(KQ2200,昆山市超声仪器有限公司);赛多利斯CP225D电子天平(赛多利期科学仪器有限公司);UV-754型紫外—可见分光光度计(上海第三分析仪器厂);KDM电子调温电热套(龙口市先科仪器公司);索氏提取器(广东中山科宇化学仪器有限公司)。1.2试剂硫酸、重蒸苯酚、无水氯化钙(均为分析纯),D-无水葡萄糖(天津市广成化学试剂有限公司,批号200508218),水为双蒸水。1.3无蚤壁虎中药鉴定无蹼壁虎药材购自药房及药材市场。所用药材经由山东中医药大学中药质量控制与评价实验室石俊英教授鉴定均为无蹼壁虎GekkoswinhonisGüenther。2方法和结果2.1水溶液多糖的提取精密称取多份壁虎药材粉末(过四号筛)各2.0000g,于五氧化二磷干燥器中干燥12h,置索氏提取器中,加入适量乙醚,加热回流提取8h,弃去乙醚,药渣挥干乙醚后置圆底烧瓶中,以备提取水溶性多糖。2.2对照品溶液的制备精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖100mg,置100mL容量瓶中,加水溶解并定容至100mL,摇匀,即得对照品溶液(葡萄糖浓度为1.0000mg·mL-1)。2.3苯酚分光光度法精密吸取对照品溶液40μL,置10mL具塞试管中,加水补至2.0mL,加入6%的苯酚溶液1.0mL,混匀。迅速加入浓硫酸5.0mL,混匀,放置5min。将试管置于沸水浴中加热15min,取出,冷至室温。在490nm波长处测定吸光度。重复操作6次,计算葡萄糖吸光度的相对标准偏差RSD为0.98%,结果表明仪器精密度良好。2.4分光光度法精密吸取对照品溶液0、20、40、60、80、100μL,分别置10mL具塞试管中,加水补至2.0mL,后分别加入6%的苯酚溶液1.0mL,混匀。迅速加入浓硫酸5.0mL,混匀,放置5min。将试管置于沸水浴中加热15min,取出,冷至室温。在490nm波长处,以第1支试管中溶液为空白对照,按照分光光度法(《中国药典》2010年版一部附录VA),测定其余5支试管中溶液的吸光度。以葡萄糖含量为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,得到的线性回归方程为:Y=0.0162X-0.0034(r=0.9991),线性范围为0～100μg。2.5因素试验采用正交试验法对壁虎药材多糖提取工艺进行优选,本试验选取3个主要因素:A超声时间、B溶剂量(即料液比)、C醇沉浓度,每个因素设3个水平,选用了L9(34)正交表,以多糖含量为指标进行试验。因素水平表见表1。2.6sevage试剂法向样品预处理后得到的药渣中加入B倍量的水,超声提取Amin,静置1h,过滤。精密吸取滤液1mL,用乙醇醇沉至乙醇浓度C,混匀,静置0.5h,4000r·min-1离心10min。弃上清液,向试管中加入1mL水溶解沉淀。后向溶液中加入2mLSevage试剂(氯仿∶正丁醇=4∶1),混匀,4000r·min-1离心10min。吸取上清液至新的具塞刻度试管中,加水将体积补至2mL,混匀,得供试品溶液。2.7因素影响因素正交试验设计结果见表2,方差分析见表3。从方差分析表可以看出,FB=3.770,FC=73.923,P值均小于0.05。按α=0.05检验水准,可认为因素B(溶剂量)、因素C(醇沉浓度)均有显著性,为主要影响因素;FA=0.314,P值大于0.05,认为因素A(超声时间)无显著性,为次要影响因素。结合表3的实验数据,认为壁虎多糖提取的最佳工艺为A1B3C3,即超声提取时间为20min,溶剂量为30倍,醇沉浓度为90%。2.8稳定性试验按照2.6项下分别制备供试品溶液,精密吸取供试品溶液2.0mL,于0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h测定吸光度,得RSD=1.71%,结果表明供试品3h内稳定。2.9重复性测定结果按照2.6项下分别制备供试品溶液,平行处理6份,每份2.0mL,测定吸光度,计算出总多糖含量,得RSD=1.66%,结果表明样品测定符合技术要求,重复性良好。2.10加样回收率试验精密称取样品6份各1.0000g,精密加入葡萄糖对照品7.1mg,按照供试品溶液制备方法制备,测定吸光度并计算加样回收率,结果如表4。平均回收率为97.65%,RSD为1.42%。结果表明,加样回收率符合要求。2.11工艺稳定性验证按照筛选出的最佳提取工艺,提取3批样品进行验证试验,根据标准曲线,计算出样品中以葡萄糖计的总多糖含量(mg·g-1),分别为7.1044、7.0533、7.2089,RSD为1.11%,结果表明此工艺稳定、可行。3超声提取时间和方法的选择、使用和测定多糖通过正交试验设计确定了壁虎药材中多糖的最佳提取工艺为:超声时间20min,溶剂量30倍,醇沉浓度90%。减小了壁虎药材中多糖含量测定的误差,更加准确的反应出样品中多糖的含量。本研究首次采用超声法提取壁虎药材中的多糖。与传统工艺相比,超声波产生的强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等,都可加速药物有效成分进入溶剂,提取效率高,省时节能,节约溶剂,并且免去了高温对提取成分的影响。从本实验的正交试验结果可见,超声提取的时间为次要影响因素,因此选择20min,既省时又节能。多糖的测定目前尚无统一的方法,文献报道多糖的检测方法可分为两类:一类是直接测定多糖本身,如高效液相色谱法和酶法;另一类是利用比色法如苯酚-硫酸法、硫酸-蒽酮法等测定多糖。前者需要昂贵的仪器、多糖纯品和特定的酶,且操作繁琐,在应用中受到限制;后者方法简便、快速,故本实验采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。经过方法学考察,测定结果稳定、可靠。动物多糖具有抗肿瘤、提高免疫力、抗血