木聚糖酶活力测定方法的研究进展

木聚糖酶活力测定方法的研究进展

木聚糖酶是目前饲料行业中应用广泛的酶。具有实际应用价值的木聚糖酶是通过微生物发芽法生产的。固态发酵生产的木聚糖酶产品中往往含有其他非淀粉多糖酶,如纤维素酶、葡聚糖酶、果胶酶和甘露聚糖酶等,适合于用作饲料酶,与非淀粉多糖酶一样,木聚糖酶有很多同功酶。实际生产中,木聚糖酶的生产菌种多种多样,发酵酶活的差异也很大,使用效果更是千差万别。制定一个科学的评判方法(或者“标准”),对于规范饲料酶市场和促进行业健康发展都是很有必要的。饲料用木聚糖酶的实际作用底物是不溶于水的高聚物,它们主要存在于植物种子的表皮层内,与葡聚糖、果胶、甘露聚糖、木质素和蛋白质等生物大分子结合在一起。在天然木聚糖与水组成的多相体系中,酶总是处于底物不饱和状态,因此难以用测定酶反应初速度的方法测定酶活力。酶与底物的反应是在固相界面上进行的,其酶解反应速率受到底物对酶蛋白吸附速率和产物扩散速率的限制,所以选用实际反应底物进行分析是很困难的。目前通常采用的底物是溶于水的木聚糖,如燕麦木聚糖和桦木木聚糖,当然其测定值要比实际发挥作用的酶活高出很多倍。饲料用木聚糖酶的分析测定是长期以来困扰木聚糖酶生产和应用的一个主要难题。在试验过程中会发现木聚糖酶测定的重复性较差,除了温度和pH值以外,还存在着其他一些不确定的因素。对于饲料用酶制剂,测定温度一般都选择在37℃,pH值选择为5.5。本文将从底物性质和浓度、酶样稀释度、离子强度和反应时间等方面讨论对木聚糖酶活测定的影响,提出可行的分析方法。1检测木聚糖酶活力的方法测定木聚糖酶活力的方法主要有以下3种:(1)黏度法;(2)底物染色法;(3)还原糖法。1.1解速度ld黏度法是通过测定木聚糖酶对底物黏度的降解速度来计算酶活力,这种测定分析方法有较好的实用价值,但是测定过程比较繁琐,而且重复性较差,目前很少采用。1.2染料溶液中木聚糖的检测底物染色法是一种比较简便快速的测定方法,其基本原理是以木聚糖为基质,用胶联方式连接和包裹特定的染料,制成染料含量均衡,质量稳定的片剂。这种片剂容易溶于水溶液中,与木聚糖酶反应后,长链木聚糖被降解,结合的染料分子被释放到溶液中,通过测定溶液中染料浓度就可以就算出酶活。这种测定方法经常被一些专业生产生物酶的大型企业采用,但是,它只能测定特定的木聚糖酶活力,不具有代表性。1.3内切酶活力的测定还原糖法是通过测定还原糖产量来计算酶活。这种分析方法比较简便,而且重复性也比较好。国内外关于木聚糖酶的研究报告多数采用这种方法,它的不足是不能很好地分析内切酶活力,而内切酶活力对于饲料酶的实际使用效果来说是很重要的。如果希望通过测定木聚糖酶在某一标准状态下的活力来判断木聚糖酶质量的优劣或者预测其动物饲喂效果是远远不够的。大量实践证明,影响木聚糖酶(也包括其他饲料酶)实际使用效果的因素很多,从目前的研究进展分析,制定一个绝对公平的标准是不可能的。综合上述因素,采用还原糖法,仔细分析影响酶活测定值的因素并结合生产实际,制定相对公正的评判标准是可行的,也是比较科学的。2条件分析2.1木糖浓度的测定确定酶解产物浓度与吸光度标准曲线的线性范围是酶活测定的前提,本试验采用还原糖法测定木糖浓度,其线性范围为:木糖浓度0.2~0.7mg/mL,吸光度0.15~0.70(图1)。2.2木聚糖酶的检测方法从酶组成分析可以发现,木聚糖酶存在着底物作用的特异性(表1)。工业生产中使用的木聚糖酶主要有两大类,一类是用于饲料,另外一类用于造纸。用于饲料的木聚糖酶应该以降解燕麦木聚糖的能力为主要检测指标,而用于造纸工业的木聚糖酶应该以降解桦木木聚糖为主要分析指标。与纤维素酶一样,木聚糖酶也是一种复合酶。在实际使用过程中,单纯比较某一种酶活指标是不够的,但是要想全面衡量饲用木聚糖酶的活性和使用效果也是很困难的。目前,国内外研究报道通常以降解燕麦木聚糖活力作为主要指标,主要是因为燕麦木聚糖测定相对比较容易,重复性也比较好。因此,建议测定饲料用木聚糖酶活力的行业标准也以测定降解燕麦木聚糖活力为主要指标。2.3燕麦木聚糖的溶解底物浓度对测定值有重要影响,这主要与酶反应米氏常数Km值有关。图2是3种菌种产生的木聚糖酶,它们要求的饱和底物作用浓度(使酶活发挥达到99%饱和活力时的底物浓度)有一定差异。从理论上分析,底物浓度越高分析的偏差越小,但实际上并非如此。过高的底物浓度也会对测定结果产生不利影响。燕麦木聚糖比较难溶于水,需要先在碱性条件下加热,然后才能溶解。如果配制浓度过高,底物溶液中的还原糖和低聚糖含量增大,使测定本底值升高,所以过高的木聚糖浓度是不必要的。目前,市场上流行的木聚糖酶其结构基因也是来自曲霉菌或者细菌,而细菌产生的木聚糖酶(包括其他酶种)其饱和底物浓度远低于曲霉菌产生的酶。燕麦木聚糖在中性条件下很难溶解,在溶解燕麦木聚糖底物时可以先在氢氧化钠碱性溶液中溶解,然后再用醋酸溶液调节到所需酸碱度。事实证明,这种方式是比较好的,所产生的本底还原糖浓度也是很低的,对测定结果影响很小。2.4离子强度的影响反应液离子强度对酶活测定结果也有影响。如图3所示:在不同离子强度条件下测定纤维素酶的活力,结果有较大差异。溶液的离子强度影响酶分子的空间构像,从而影响了酶分子活力的发挥。所以,在测定过程中应统一反应液的离子强度,这一点往往被人们忽视。那么究竟应该选择何种离子强度比较合适,答案目前还没有统一。不同酶系要求的最佳离子强度各不相同,需要经过探索才能确定。根据畜禽消化道生理状况,建议反应液离子强度0.1mol/L。2.5木聚糖酶系的检测结果为了使获得的测定值尽可能准确,不仅需要选择在线性反应范围内,而且应该有足够的线性反应时间。在线性反应条件下,延续作用时间越长,测定的相对误差也越小。大量研究发现,不同酶系其线性作用时间各不相同。一般情况下,酶系复杂的组分线性作用时间较长;而酶系简单的组分,线性作用时间较短。图4是两种典型的木聚糖酶系。硫色曲霉(A.sulphureusMAFIC-001)产生的木聚糖酶A线性作用时间接近100min,黑曲霉(A.nigerMAFIC-005)产生的木聚糖酶B线性作用时间不到60min。从文献报道的数据和笔者的试验结果发现,比利时生产的一种由细菌发酵产生的木聚糖酶C线性作用时间最长,可达8h左右。线性反应时间最短的商业木聚糖酶是由一种木霉发酵产生的,线性反应时间不到20min。另外,许多试验还发现,酶系简单要求的饱和底物浓度比较低,同时线性作用时间也较短;而酶系复杂要求的饱和底物作用浓度较高,线性作用时间也较长。酶反应的线性作用时间长,对分析产物本底值含量高的酶产品是很有利用价值的。在实际测定过程中,为了消除产品的产物本底误差,必需适当加大稀释度。此时就要尽量延长酶反应时间,使形成的产物量尽可能与本底值拉开距离。这种情况特别适用于测定活力比较低的酶产品。2.6对于意识外来分子的稀释度有利于发挥酶活力酶分子浓度对测定结果也有重要影响,表2是关于硫色曲霉固态发酵制品中的木聚糖酶活力测定值与稀释率的关系。确定酶样稀释度实质上是选择酶分子的数量与底物分子的数量之间的比例,两者比例只有在一定范围内,酶分子活力才能得到充分发挥,超越了这个比例范围,酶活力发挥受到影响。其情形类似于生产企业,产品数量并不总是随着工人数量的增加而呈正比例增加。所以在测定酶活时需要做酶样稀释梯度,梯度的间隔不能太大,最好是加倍稀释,以确定合适的线性测量范围。2.7不同存放时间对本底还原糖活性的影响木聚糖酶的反应底物是多聚物,长时间存放会使底物分解,产生较多的小分子寡聚物和单体,使测定值偏高,同时还会造成较高的本底值,影响测定精度。笔者分析了1.0%木聚糖底物溶液在4℃条件下的存放时间对本底还原糖浓度的影响,结果见表3。木聚糖属容易降解的多糖。在4℃冰箱存放2d,降解产生的还原糖达到0.142mg/mL,这个本底值对酶活测定结果有很大影响。建议底物配制后的存放时间不超过12h,最好现配现用。3固定反应体系综合上述分析结果可以发现,除了pH和温度以外,底物性质和浓度、酶分子浓度、反应时间、溶液离子强度和体系运动状态都能影响酶的测定活力。由于这些影响因素的存在,使得酶活测定变得纷繁复杂,同一种酶在不同条件下分析获得的结果存在很大偏差。为了测定的统一,同时使结果有较好的可比性,建议固定反应体系,即固定反应温度、pH值、反应时间、底物浓度和要求的产物浓度范围。样品酶做不同的稀释度,只有在规定条件下产生所要求的产物浓度范围的稀释酶液才是有效的作用酶液,然后,以此为依据计算酶活。这种方法虽然比较繁琐,但是它排除了许多干扰,有较好的可比性。对于饲料用木聚糖酶活力的分析测定,建议以燕麦木聚糖