金属离子对木聚糖酶活性的影响

金属离子对木聚糖酶活性的影响

饲料中的许多养分，如粗蛋、果质、纤维、半纤维和木质素，很难直接用于动物饲料。这不仅浪费了饲料，而且污染了环境。饲料酶的出现对解决这个问题起到决定性作用,酶制剂能利用潜在的饲料资源,破坏或去除常用饲料中的抗营养因子,开发新的饲料资源,调节理想氨基酸的平衡以降低日粮中的蛋白水平,消除氮、磷等所造成的环境污染问题。蛋白酶、果胶酶、纤维素酶和木聚糖酶等饲用复合酶可以将饲料原料转变为简单物质而被吸收利用,从而提高饲料转化率,同时能减少污染,改善环境。木聚糖酶能降解木聚糖,提高麦类日粮的营养价值,在饲料中的应用也越来越广泛。在饲料加工和使用过程中,作为添加剂,酶制剂首先要与矿物质预混料和维生素预混料预混合,由此导致添加到饲料中的酶经过一段时间后活性降低。饲料中金属离子的来源首先包括配制饲料用的动植物原料本身的微量金属元素,这些金属元素以游离或络合状态存在于动植物体;其次,由于动物生长需要,在制作饲料时,生产厂家还要根据对饲养对象的营养需求,添加不同种类和不同比例的常量和微量金属元素,如铁、钴、铜、锌、锰等。针对这种情况,笔者选择8种常见的金属离子,对自行生产的4PCA饲用复合酶进行离子稳定性研究,以期为酶制剂的稳定性研究及在饲料工业中的应用研究提供参考。1材料和方法1.1材料1.2o、khpo43h2o、cacl2、mnso43h2o、cuso47h2o、cuso47h2o、znso47h2o4PCA饲料复合酶,黄褐色粉末,由陕西省科学院酶工程研究所研制。Na2HPO4·12H2O、K2HPO4·3H2O、CaCl2、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O均为分析纯,购自西安化玻站。主要仪器:721型分光光度计,调温水浴锅,分析天平,pH计,移液枪及枪头,冰箱,电炉等。1.23-5-二硝酸法dns法用于测定酶活1.2.1以激活单元为定义饲用木聚糖酶在50℃,pH值4.8条件下,1min分解底物产生1μg还原糖所需的酶量为一个活力单位。1.2.2试剂1%燕麦木聚糖(Sigma公司);pH值4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液;DNS试剂;1mg/ml木糖标准溶液。1.2.3酶溶液的制备需要测定称取1.0000g4PCA饲料复合酶,用缓冲液充分浸提溶解后,用4层脱脂纱布过滤,取滤液按需要稀释一定倍数。1.2.4木糖标准使用溶液和ds试剂的制备取6支20ml刻度试管,分别加入1、2、3、4、5、6ml的浓度1mg/ml木糖标准溶液,用蒸馏水分别加至10ml。摇匀后,即为每1ml含木糖100、200、300、400、500、600μg的木糖标准使用溶液。按1~6号顺序分别吸取1ml木糖标准使用溶液于刻度试管中,再加入1ml蒸馏水和2mlDNS试剂,0号加入1ml蒸馏水和2mlDNS试剂作空白对照,混匀后沸水浴反应10min,冷却后用水定容至15ml,摇匀后用10mm比色杯在540nm处测定吸光度OD值。以OD值为横坐标,D-木糖浓度为纵坐标作标准曲线1.2.5空白、比色杯法吸取稀释酶液0.2ml于比色管中,加入木聚糖溶液1.8ml混匀,具塞;在(50±0.1)℃水浴中反应30min后,立即加入2mlDNS试剂,沸水浴反应10min,快速冷却后用水定容至15ml(样品作3个平行)。空白除了将0.2ml酶液于(50±0.1)℃水浴后加入之外,其他步骤相同。以空白调零,用10mm比色杯在540nm下测OD值。按下式计算木聚糖酶活力:X=A×5×N×1000/(30×W)式中,X为酶活力(U/g或U/ml);A为OD值在标准曲线上对应的D-木糖量(mg);N为稀释倍数;×1000指1mg换算成1000μg;30指反应时间(min);W为取样量(g或ml)。1.2.6相对酶活性的测定取1g4PCA饲料复合酶,用pH值4.8的柠檬酸缓冲液充分溶解并浸提30min后定容,经4层脱脂纱布过滤,滤液保存至0~4℃冰箱内备用,用时稀释一定倍数。用蒸馏水配制一定摩尔浓度的金属离子溶液,用时稀释至需要的浓度。用等体积蒸馏水代替离子溶液作空白,测定酶液在不同浓度不同离子溶液下40℃保温30min后的相对酶活。进行了8种金属离子在1×10-4、1×10-3、1×10-2mol/L3个浓度下对木聚糖酶活性的影响试验。2单个金属离子对木聚糖酶活力的影响由表1可知,8种金属离子在1×10-4mol/L的低浓度下对酶的活性无明显影响。在1×10-3mol/L的中离子浓度下,Cu2+对酶活有明显的激活作用,可使木聚糖酶活增大至125.8%;而Mn2+对酶活的抑制作用十分明显,使酶活降低至54.5%。在1×10-2mol/L的高金属离子浓度下,Zn2+可使酶活增至121.5%;相反,Mn2+有很强的抑制作用,使酶活降低至40.6%;Cu2+也丧失其激活作用反而使酶活迅速降至67.7%;Fe2+也有一定的抑制作用。从单个金属离子来分析,K+、Na+、Mg2+、Ca2+在3种浓度下对酶活的影响都不大;Mn2+在低浓度时无明显影响,当浓度继续增大,其抑制作用愈加明显,使酶活大幅降低;Zn2+随着离子浓度的增大,其激活作用也有所增加;Cu2+在低浓度向中浓度过渡时,对木聚糖酶活力的激活作用更加明显,尤其在中等离子浓度下,可使酶活激活至最大,当离子浓度继续增大时,激活作用迅速下降,而且表现出很强的抑制作用,使酶活大大降低。Fe2+对酶活表现出微弱的抑制作用。3z2+、c2+、ca2+、ca2+、me2+对酶活的影响试验结果表明,不同金属离子在不同的浓度下对4PCA饲料复合酶中木聚糖酶的活力影响有所不同。总体来说,K+、Na+、Ca2+、Mg2