大口黑鲈虹彩病毒病的研究进展

大口黑鲈虹彩病毒病的研究进展

大口黑鱼（俗称美国坚果，发生在北美密歇西比河流域。它是一种无性系鱼类。它生长迅速，病虫害少，耐低温，肉质细腻，易于吞咽。在20世纪70年代开始普及于世界各地。我国广东佛山顺德地区是大口黑鲈的主要养殖区。2008年至2010年初,顺德地区大口黑鲈养殖鱼塘大面积暴发疾病,造成重大经济损失。对濒死鱼剖检发现鱼鳔肿大,布满红色气腺。鱼鳔、肾脏研磨除菌后,接种鲤鱼上皮瘤细胞(EpitheliomaofPapulosumcyprini,EPC)分离到致病性大口黑鲈虹彩病毒(Largemouthbassranavirus,暂命名LMBV-C株)。LMBV在大口黑鲈国内主养区的暴发引起了我们对该病的关注。由于国内对LMBV的研究报道较少,为了对LMBV进行深入的了解,并对该病的研究与防控提供参考,本文将目前国内外已有的关于LMBV的研究报道进行综述。1大口黑地震病毒及病毒分类大口黑鲈病毒最早分离自1991年美国佛罗里达州LakeWeir市的野生大口黑鲈。1995年美国南卡罗莱纳州的Santee-Cooper水库养殖的大口黑鲈暴发鱼灾(fishkill)引起人们高度关注,此后两三年内,在美国阿拉巴马州、乔治亚州、路易斯安那州、密西西比州和德克萨斯州相继暴发不同程度鱼灾,经病原分离鉴定为大口黑鲈病毒。1996年,PlumbJA等通过实验室分离鉴定将大口黑鲈病毒归类到虹彩病毒科,1999年MaoJ等综合大口黑鲈病毒蛋白合成分析,限制性片段长度多态分析(restrictionfragmentlengthpolymorphisms,RFLP),主衣壳蛋白(majorcapsidprotein,MCP)和DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferase,DMet)基因序列分析的结果,明确了大口黑鲈虹彩病毒的分类地位为虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒属(Ranavirus)成员。MaoJ等还比较了LM-BV、裂唇鱼病毒(Doctorfishvirus,DFV)、孔雀鱼病毒(Guppyfishiridovirus,GV6)、蛙病毒3(Frogvirus3,FV3)等的MCP和DMet基因的氨基酸序列,以及它们的限制性内切酶图谱,结果显示DFV、GV6和LMBV之间同源性高,与蛙病毒代表株FV3有一定差距。因此,MaoJ建议LMBV、DFV和GV6组成蛙病毒属的新种,在国际病毒分类委员会第八次报告中将LMBV、DFV、GV6归类为蛙病毒属的Santee-Cooperranavirus种,该种名也反映了LMBV导致鱼灾的暴发地点。2大口黑病病毒病对美国的影响目前对于大口黑鲈病毒的研究报道仍然是以大口黑鲈原产地美国为主。自从1995年在美国南卡罗莱纳州的Santee-Cooper水库暴发LMBV导致的鱼灾,此后,美国东南部又暴发了几次大口黑鲈大规模死亡病例。目前,美国已经报道发生大口黑鲈病毒病的州包括阿拉巴马州、阿肯色州、佛罗里达州、乔治亚州、伊利诺斯州、印第安纳州、肯塔基州、路易斯安那州、密歇根州、密西西比州、密苏里州、北卡罗莱纳州、俄克拉荷马州、南卡罗莱纳州、田纳西州、德克萨斯州、维吉尼亚州、佛蒙特州、威斯康星州等。GroocockGH等发表的研究结果显示,其在纽约州37个地区收集了283尾野生大口黑鲈和8尾小口黑鲈,采用定量PCR(QPCR)的方法对来自13个地区的28尾鱼检测LMBV显示阳性,证实美国纽约州也存在LMBV。大口黑鲈虹彩病毒在其他国家的暴发鲜有报道,邓国成等报道了大口黑鲈溃疡病是由虹彩病毒感染引起的,这是国内对大口黑鲈虹彩病毒导致溃疡病的首次报道。3水体传播lmsv一般认为健康鱼感染LMBV主要是通过在水体里接触病原或者食入带病鱼饵,人工感染实验和孵化场还未发现垂直传播的病例。由于对LMBV天然宿主的范围缺乏系统调查,其通过水体传播病毒的作用仍然不能忽视。ShubhankarN等也已经证实,荧光假单胞菌生物膜(biofilm)和池塘混合生物膜包裹的LMBV,保留对EPC细胞的感染能力,并对次氯酸钠、碘复合物等消毒剂具有一定抵抗力。除了鱼类,实验室感染试验证实,LMBV在两栖类和禽类中可以存活,水陆传播LMBV也就成为可能。国外有众多的垂钓俱乐部,大口黑鲈是主要的竞钓品种之一,因此通过垂钓者和船只传播病毒也是重要途径之一。4混合感染的原因LMBV不仅可以导致大面积鱼暴发疾病死亡引起鱼灾,也可以是不表现任何症状的隐性带毒,这给疾病诊断带来困难。对该病的诊断必须综合流行情况、症状、剖检、病毒分离鉴定等进行判定。该病一般在夏季暴发,30℃的水温是病毒复制和人工感染试验的理想温度。因此,夏季大口黑鲈暴发不明病因、无明显症状的大批死亡,首先怀疑是否LMBV感染。自然感染病毒的大口黑鲈,一般浮在水面,大多没有肉眼可见典型症状,但剖检可见鱼鳔膨大,布满红色气腺。有时鱼鳔中有黄色或褐色蜡样分泌物。在对该病进行临床诊断时,即使出现上述症状,也不能仅仅怀疑是LMBV感染,必须考虑其他病原感染的可能性,因为外表健康的大口黑鲈中也可以分离到LMBV,LMBV可能并不是导致发病的主要原因。LMBV的分离与鱼类其他病毒相比较为容易,因为该病毒可以在许多常见细胞系如鲑科、鲤科、鮰科鱼类细胞上增殖,引起明显的细胞病变效应(cytopathiceffect,CPE)。但由于病毒在组织中拷贝数存在差异,有时病毒的细胞分离未必成功。2001年7月份美国阿拉巴马州进行LMBV的流行病学调查,采用细胞培养方法检测LMBV阳性率为13%,采用PCR方法检测得到的阳性率为57%。可见,分子生物学方法如PCR和血清学方法如ELISA,可以很好地辅助病原的鉴定。此外,采用定量PCR检测方法可以精确计算各感染组织中病毒拷贝数。在混合感染情况下,LMBV的作用仍然未知。可能是其他病原感染导致机体免疫力下降,使得LMBV能够快速增殖到被检测水平,也可能是感染LMBV后,鱼类对其他病原更易感。5感染lm-bv的致病机制LMBV不仅仅感染大口黑鲈,还感染太阳鱼科的小口黑鲈,斑点黑鲈,蓝鳃太阳鱼,红胸太阳鱼,白刺盖太阳鱼和黑斑刺盖太阳鱼,但目前发现其只对大口黑鲈有致死性。ZilbergD等进行LMBV的人工感染试验,结果显示,以106.2TCID50/0.1mL剂量通过腹腔注射的方式攻毒,感染后第3天,病鱼呈现螺旋状游动,第4天病鱼体色发黑、无活力、腹部轻度膨大。攻毒鱼在3d~5d内全部死亡,濒死鱼组织中检测到病毒含量为107.8~109.2TCID50/g。濒死鱼剖检后,观察到肝脏表面局部苍白,脾脏鲜红色,肠系膜和靠近盲肠部位的脂肪有充血现象。组织病理学结果显示,所有感染鱼都有急性腹膜炎症状,这与同种属病毒DFV和GV6引起的病变不同,后者往往导致造血器官坏死病变。感染LM-BV的鱼肝脏、胃、肠道和脾脏表层部分出现坏死和炎性病变,但是深层部分表现正常。鱼鳔与腹腔接触表面有纤维蛋白渗出物。胃肠道的黏膜上皮层有局部坏死病灶。所有感染鱼在注射部位有2mm~3mm大小的炎症病灶,可能是注射引起的一过性损伤。BerkBH等以1.7×103pfu/mL剂量采用浸泡方式对225尾平均体重79g的大口黑鲈攻毒,所有濒死鱼浮在水面,鱼鳔极度膨胀。感染鱼组织器官病毒检测显示,攻毒4d~5d是感染高峰期,鱼鳔、鳃和后肾是最容易受LMBV侵袭的器官。由于在自然环境下,大口黑鲈隐性带毒的情况比较普遍,因此LMBV的致病性存在差异。InendinoKR等研究了环境应激因素对LMBV发病的影响,试验证实水体环境的剧烈变化、饲养密度过大都会导致感染LMBV的大口黑鲈病死率上升。单靠LMBV导致鱼灾在自然条件下可能性并不高,大部分研究人员还是认为协同感染,环境剧变如水温突然上升、溶氧降低,会导致该病的暴发。6临床表现正常的带毒鱼l改由于LMBV在发病机理、流行病学方面的研究并不深入,再加上野生鱼类带毒情况的普遍性,目前对LMBV还没有采取有效的防控措施。很多研究者也期望通过对各种外界因素与发病的研究,探讨切断LMBV感染并导致鱼灾的可能性。GregoryMS等在美国德克萨斯州进行为期数年的跟踪调查,发现LMBV的感染与外伤、钩形标记、外寄生虫、性别、抓捕方式、体长、体重等因素均没有显著关联。不过,尽管如此,加强日常管理对于该病的散播和流行仍然是必不可少的。对于任何新老病原,多数研究人员提出还是从导致病害发生的常规的三个因素宿主、病原和环境入手。目前已有研究证明,环境的恶变会导致LMBV的暴发,如水温的升高,溶氧降低,频繁捕捉等。人工感染试验也已经证实,有些鱼一旦感染上LMBV,几天之内就能产生症状;同样条件下,有些鱼不会产生任何症状,但是可以携带病毒。说明个体上的差异也是存在的。对于这些临床表现正常的带毒鱼,有几个疑问尚未解决:(1)这些临床表现正常的鱼是否已经从感染中恢复,只是不能将病毒从体内清除;(2)这些带毒鱼以后是否会发病;(3)这些带毒鱼是否已经产生抵抗力;(4)这些带毒鱼其实已经发病,只是症状不明显。怎样控制这些无症状带毒鱼到处传播病毒是目前防控的难题。从2000年开始,美国私人组织———鲈鱼垂钓爱好者协会(BassAnglersSportsmanSociety,简称BASS)每年发起并主办关于LM-BV的研讨会,邀请来自各州、联邦机构、高校的管理者、专家和研究人员共同探讨LMBV的解决办法,这一做法一直持续到现在,对于跟踪LMBV的散播、确定发病相关因素起到了非常积极的作用。7大口黑地震病病毒防控的展望从20世纪90年代开始,中国池塘养殖大口黑鲈发生的病害越来越复杂,烂鳃病、肠炎病、腐皮病、水霉病、车轮虫病、杯体虫病等暴发时有报道。导致大口黑鲈发病的病原主要是嗜水气单胞菌、柱状黄杆菌、霉菌和寄生虫,确诊由病毒感染导致发病的报道较少,2009年邓国成等人报道的大口黑鲈溃疡病是由虹彩病毒感染引起的,这也是国内对LM-BV的首次报道。经过20多年的驯化饲养,大口黑鲈的养殖量在国内颇具规模,但LMBV在国内还未引起足够的重视,归因于其感染性虽然广泛,但是引起大规模致死性暴发的病例报道并不多,再加上鱼病症状复杂,许多未进行病毒分离鉴定的病例也将其简单归结于细菌感染。目前,虹彩病毒病的防控方面没有特效药物。在虹彩病毒科的5个病毒属中,由于肿大细胞病毒感染商业价值较高的淡水和海水鱼类,其致病机理和疫苗研发也一直是近几年研究的重点。如日本已经研发并商品化真鲷虹彩病毒(Redseabreamiridovirus,RSIV)注射型全细胞灭活疫苗,并且针对RSIV研发的DNA疫苗也显示出良好的保护效果。但是对于大部分已经报道的肿大细胞虹彩病毒来说,因为难以实现在常见鱼类细胞中增殖,细胞苗的开发有一定难度。蛙病毒在感染细胞方面具有得天独厚的优势,不仅可以感染许多鱼类细胞系,在一些常见哺乳动物细胞系如幼仓鼠肾细胞(BHK)、人宫颈癌上皮细胞(Hela)、人肾上皮细胞系(293T)上也能进行正常增殖