SZDB∕Z 313-2018 H5N6 亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测

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SZDB/Z

H5N6亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR

for

of

subtype

H5N6

avian

virus2018-07-

深圳市市场监督管理局

SZDB/Z

2018目次前言

................................................................................

II

范围

...............................................................................

规范性引用文件

.....................................................................

术语和定义

.........................................................................

原理

...............................................................................

仪器与试剂

.........................................................................

生物安全要求

.......................................................................

样品采集和前处理

...................................................................

核酸取

...........................................................................

核酸取

...........................................................................

10

......................................................................

11

结果判定

..........................................................................

附录

试常用剂配制....................................................

RT-PCR

反应体系配制

....................................

附录

H5N6

..............

SZDB/Z

2018前 言

IISZDB/Z

2018

亚型禽流感病毒实时荧光

检测方法

GB

19442

CT值CYCLE

荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶发挥5’→3’的外切核酸酶功能，将探针降解。这样探针上的荧光基团游离出来，所发出的荧光不再为淬灭基团所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环

5.1

SZDB/Z

2018

r/min

1000

L,

1000

5.2

HA

ACA

GTG

GCG

AGT

TCC

CTA

GCA-BHQ1-3’HA

TAT

GAC

TAY

CCA

CAR

TAY

TCA

HA

CCA

GCT

AYC

ATG

ATT

GC3’NA

NA

NA

NA

探针

BHQ，或者可以选择标记其它荧光基团及其相应的淬

DNA

RNA

100

RNA

样品的采集、保存及运输应符合GB

19489、GB/T

SZDB/Z

2018

将两个灭菌的棉拭子于PBS溶液中浸湿，取一个棉拭子先插入活禽喉头口及上腭裂来回刮3～5次并旋转2～3次；将咽喉拭子和泄殖腔棉拭子一起放入盛有1mL灭菌的0.01moL/L

PBS(内含青霉素

可随机采集

1g

g。

将采集的样品于旋涡振荡器上振荡混匀约5s后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，弃去拭子，

将所采组织病料置于洁净、灭菌并烘干的研磨器中，按质量体积比（1:1）加入样品保存液进行充分研磨，3000

L，再加入

200

氯仿，混匀器上振荡混匀

s，于

12000

r/min

离心

15

min。

400

移至相应的管中，避免吸出中间层，颠倒混匀于

4℃

12000

r/min

15

4℃

10

10

s，用微量加样器将其吸干，室温干燥

5～10min。

DEPC

r/min

离心

SZDB/Z

2018H5N6亚型禽流感病毒核酸取也可以采用等效RNA取试剂及方法：如采用自动化核酸抽仪和配

（附录B以AgPath-IDTM

试剂盒为例，列出反应体系配制表，仅参考）将配制的每

加样

a)

45℃

30min；b)热启动

95℃

10min(不同试剂的反应条件不一，应根据说明书进行)；c) 95℃

45s，40

个循环，58℃时设置采集荧光。

Report

10.2质控

Ct

有明显的对数增长期（典型扩增曲线的图例见附录

在试验成立的条件，FAM及HEX通道结果均呈现Ct值≤35且呈现典型扩增曲线，判为荧光PCR阳性SZDB/Z

2018

检测经40个循环无Ct值且不出现扩增曲线，或者只出现单一通道有荧光信号，判为荧光PCR阴性反

SZDB/Z

2018

A.1

0.01mol/L

磷酸二氢钾（KH2PO4）