微生物工程思考题

微生物工程指导1、什么是微生物工程？它是由哪四大技术结合发展起来？(1)微生物工程：利用微生物的特定性状和功能，通过现代化工程技术生产有用物质或直接应用于工业化生产的技术体系。(2)传统发酵，DNA重组，细胞融合，分子修饰与改造2、微生物反应过程的特点（与化学工程相比）(1)优点：（与化学工程相比）=1\*GB3①生产过程通常在常温常压下进行，操作条件温和=2\*GB3②原料以碳水化合物为主，不含有毒物质。=3\*GB3③能高度选择性地进行复杂化合物在特定部位反应，如氧化、还原、官能团导入等。=4\*GB3④生产产品的生物体本身也是发酵产物，富含维生素、蛋白质、酶等有用物质；=5\*GB3⑤通过微生物菌种改良，能够利用原有设备使生产飞跃上升。(2)发酵过程中尚存在的问题：=1\*GB3①底物不能完全转化成目的产物，副产物的产生不可避免，因而造成提取和精制困难=2\*GB3②微生物反应是活细胞的反应，产物的获得除受环境因素影响外，也受细胞内因素的影响，且菌体易发生变异。=3\*GB3③原料是农副产品，虽然价廉，但质量波动较大。=4\*GB3④生产前准备工作量大，花费高，相对化学反应而言，反应器效率低。=5\*GB3⑤发酵废水常具有较高的BOD和COD，需处理后排放。3、微生物工程的发展经历哪几个阶段？(1)传统的微生物发酵技术——天然发酵(2)第一代微生物发酵技术——纯培养技术(3)第二代（近代）微生物发酵技术——深层培养技术(4)第三代发酵技术——微生物工程4、微生物工程产品类型有哪些？(1)微生物菌体的发酵(2)微生物酶发酵(3)微生物代谢产物发酵(4)微生物的生物转化(5)微生物特殊机能的利用5、作为发酵工业用的微生物菌种应符合哪些要求？(1)能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，并形成所需的代谢产物，产量高。(2)可以在易于控制的培养条件下迅速生长和发酵，且所需酶活力高。(3)根据代谢控制的要求，选择单产高的营养缺陷型突变株或调节突变株或野生菌株。(4)选育抗噬菌体能力强的菌株，使其不易感染噬菌体(5)菌种纯，不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定性(6)菌种不是病原菌，不产生有害的生物活性物质和毒素，以保证安全6、微生物工程工业生产水平取决于哪些因素？(1)生产菌种的性能(2)发酵和提取工艺条件(3)生产设备7、微生物菌种分离与筛选工作程序分哪几步？样品采集→增殖培养→纯种分离→生产性能测定8、微生物菌种选育的方法有哪些？(1)自然选育(2)诱变育种(3)杂交育种(有性、准性)(4)原生质体融合育种(5)基因工程育种9、菌种保藏方法中，常用于产孢子和芽孢的保藏的方法是哪一个？现逐渐被哪一种方法取代？沙土管保藏法，现被真空冷冻干燥法取代10、微生物酶活性调节的方式有哪些？(1)共价修饰(2)变(别)构效应(3)缔合与解离(4)竞争性抑制11、酶合成调节的类型有哪些？(1)诱导（2）阻遏<末端产物阻遏，分解代谢产物阻遏>12、了解酶合成调节的分子机制（乳糖操纵子和色氨酸操纵子）13、了解分支生物合成途径的调节类型(1)同工酶调节：某一分支途径中的第一步反应可由多种酶催化，但这些酶受不同的终产物的反馈调节.(2)协同反馈调节:需有一种以上终产物的过量存在方有明显的效果。单个终产物过量，不产生或只产生很小的影响(3)累加反馈调节:每一种末端产物过量只能部分抑制或阻遏，总的效果是累加的(4)增效反馈调节:代谢途径中任一末端产物过量时，仅部分抑制共同反应中第一个酶的活性，但两个末端产物同时过量时，其抑制作用可超过各末端产物产生的抑制作用的总和(5)顺序反馈调节:分支途径中几个末端产物抑制分支点后面第一个酶，使分支点产物积累，结果分支点产物又反馈抑制共同途径中的第一个酶，最后使整个代谢途径停止14、克服反馈调节的方法有哪些？(1)降低末端产物浓度(2)应用抗反馈突变株15、克服分解代谢阻遏的方法有哪些？(1)避免使用有阻遏作用的碳源和氮源(2)流加碳源或氮源(3)利用抗分解代谢阻遏的突变体16、代谢工程的定义、目的、研究对象。(1)代谢工程：利用生物学原理，系统分析细胞代谢网络，并通过DNA重组技术合理设计细胞代谢途径及遗传修饰，进而完成细胞特性改造的应用性学科。(2)代谢工程的研究目的：通过重组DNA技术构建具有能合成目标产物的代谢网络或具有高产能力的工程菌并用于生产。(3)代谢工程的研究对象：简单地说，代谢工程的研究对象就是：代谢网络（细胞分解代谢途径、合成代谢途径和膜传输系统的有序组合构成代谢网络。广义的代谢网络包括物质代谢网络和能量代谢网络。）17、代谢工程研究的设计思路①提高通向目标产物的代谢流②扩展代谢途径③构建新的代谢途径18、代谢工程的基本过程(1)靶点设计→(2)基因操作→(3)效果分析19、按培养基物理状态来分，大规模发酵工业中，常用哪一种？液体：发酵工业大规模使用的培养基20、在发酵工程中，培养基按用途分为哪三种？(1)孢子培养基(2)种子培养基(3)发酵培养基21、什么是前体？在发酵中常采用什么方式加入？为什么？(1)前体---某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而又较大的提高。(2)采用少量多次的流加工艺（大多数前体，如苯乙酸对微生物的生长有毒性；菌体具有将前体氧化分解的能力）22、什么是促进剂？什么是抑制剂？促进剂：指那些非细胞生长所必需的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。抑制剂：抑制某些代谢途径的进行，同时刺激另一代谢途径，以致可以改变微生物的代谢途径。23、淀粉水解糖的制备方式有哪些？(1)酸解法(2)酶解法（双酶水解法）(3)酸酶结合法24、掌握正交实验设计的分析方法（L934）25、什么是种子扩大培养？种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。26、工业发酵中，常用的种子应符合哪些准则？(1)菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，延滞期短。(2)生理性状稳定(3)菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求(4)无杂菌污染(5)保持稳定的生产能力27、发酵级数是如何定义的？指制备种子需逐级扩大培养的次数。决定因素：根据菌种生长特性，菌体繁殖速度，所采用发酵罐的容积28、常用于种子质量判断的参数有哪些？通常测定的参数有：(1)pH(2)培养后磷、糖、氨基氮的含量(3)菌体形态、菌体浓度和培养液外观（色素、颗粒等）(4)其它参数，如某种酶的活力；如土霉素发酵中，种子液的淀粉酶活力与发酵单位有一定关系，可通过测定种子液中淀粉酶的活力判断种子质量29、通风发酵罐分为哪几种类型？(1)机械搅拌式(2)自吸式(3)气升式(4)高位筛板式30、机械搅拌通风发酵罐应符合中哪些基本条件？通常由哪些要件组成的？(1)基本条件：=1\*GB3①适宜的径高比。[高：直径约为2.5～4]=2\*GB3②能承受一定的压力。[水压试验（1.5倍）]=3\*GB3③搅拌通风装置要能使气泡分散细碎、气液充分混合，保证发酵液必须的溶解氧，提高O2的利用率。=4\*GB3④应具有足够的冷却面积。[代谢产热]=5\*GB3⑤发酵罐内应抛光，尽量减少死角。[避免积污、染菌]=6\*GB3⑥轴封应严密，尽量减少泄漏。(2)发酵罐的结构：=1\*GB3①罐体=2\*GB3②搅拌器=3\*GB3③挡板=4\*GB3④空气分布装置=5\*GB3⑤换热装置=6\*GB3⑥消泡装置=7\*GB3⑦轴封、联轴器和轴承=8\*GB3⑧其它配置（罐顶：人孔、视镜（冲洗管）及镜灯、进料管、补料管、排气管、接种管、压力表接管、温度计管）31、发酵过程中的参数检测中，物理参数主要检测哪些指标？物理参数：温度、压力、搅拌速度、通气流量、泡沫水平、加料速率、生物热、黏度等32、什么是微生物的热阻？对数残留定律？（1）微生物对热的抵抗力称为热阻（heatresistance）（2）对数残留定律的概念：对微生物进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡的速率与残存的微生物数量成正比。33、影响培养基灭菌的主要因素有哪些？(1)微生物热阻(2)pH(3)菌的浓度(4)培养基成分(5)泡沫(6)颗粒34、简述实罐灭菌的主要步骤？(1)在进行培养基灭菌之前，通常应先把发酵罐的分空气过滤器灭菌并用无菌空气吹干。(2)预热向夹套或蛇管中通入蒸汽，间接将培养基加热至70℃左右。(3)开启蒸汽管，向培养基中通入蒸汽，升温。(4)罐压达1kg/cm2(0.1MPa)时，按装在发酵罐封头的接种管、补料管、消泡剂管等应排汽。(5)保温调节好各进汽和排汽阀门，使罐压和温度保持在一稳定水平，维持一定时间。35、连续灭菌有何优缺点？大型发酵罐常采用哪种方式灭菌？优点：=1\*GB3①可采用高温短时灭菌，培养基受热时间短，营养成分破坏少，有利于提高发酵产率；=2\*GB3②蒸汽负荷均衡，锅炉利用率高，操作方便。=3\*GB3③适于自动控制，降低劳动强度。缺点：设备复杂，投资大36、空气净化的目的是什么？除尘；除水；除菌37、目前发酵工业中最广泛使用的无菌空气获得方法是什么？介质过滤38、以两级冷却、加热除菌流程为例，说明需要哪些设备？各设备有何作用？1-粗过滤器（主要是捕集较大的灰尘颗粒）2-压缩机3-贮罐（消除空压机排出空气量的脉动，维持稳定的压力，分离部分油水）4，6--冷却器（绝热压缩）5-旋风分离器（分离空气中被冷凝成雾状的水雾和油雾）7-丝网分离器8-加热器9-总过滤器39、介质除菌的原理是什么？影响介质过滤效率的因素有哪些？原理：介质间空隙大于微生物，如棉花纤维直径16-20m，充填系数为8%时，所形成的网格空隙为20-50m。介质过滤是以大空隙的介质过滤层除去较小颗粒，这显然不是面积过滤（即不是绝对过滤），而是一种滞留现象。这种滞留现象是由多种作用机制构成的，主要有惯性碰撞、阻截、布朗运动、重力沉降和静电吸引等。影响介质过滤效率的因素：=1\*GB3①纤维直径:介质过滤效率与介质纤维直径关系很大，在其他条件相同时，介质纤维直径越小，过滤效率越高=2\*GB3②介质填充厚度=3\*GB3③介质填充密度:增加填充密度，可提高过滤效率=4\*GB3④空气流速:在空气流速很低时，过滤效率随气流速度增加而降低；当气流速度增加到临界值后，过滤效率随气流速度增加而提高。40、什么是发酵热？影响发酵温度的因素有哪些？发酵热：发酵过程中释放出的净热量。[J/m3·h]（或单位体积的发酵液在单位时间内释放出来的净热量。）影响发酵温度的因素：(1)菌种特性(2)培养基（成分及配比）(3)发酵阶段(4)搅拌类型及搅拌速度(5)通气速度（影响Q蒸发和Q显）(6)罐内外的温差41、温度对发酵的影响体现在哪几个方面？(1)温度影响产物合成的速率及产量(2)温度可能会影响终产物的质量(3)温度还可能影响生物合成的方向42、发酵罐温度的控制方法有哪些？(1)罐壁调温---------(2)夹层调温-------(3)罐内调温43、发酵过程中pH的控制方法？(1)在基础培养基配方中考虑到维持pH的需要：例如加入CaCO3，使用缓冲液等；(2)通过补加酸、碱来调节控制(3)通过中间补料来控制：例如可以根据生产菌的代谢需要用改变加糖速率来控制pH,也可通过中间补加尿素或硫酸铵等调节44、基质浓度对发酵有何影响？(1)对生长的影响（可用Monod方程来描述基质浓度与生长速率的关系）S＞＞Ks，趋向于max然而，由于代谢产物或基质浓度过浓可能会导致抑制作用，出现比生长速率下降当浓度超过某值，还可能导致细胞脱水(2)对产物形成的影响=1\*GB3①基质浓度对产物形成的影响类似于生长=2\*GB3②在一定范围内，基质浓度大，通常产物产量高=3\*GB3③过浓，使菌体生长过于旺盛，发酵液非常粘稠，传质状况差，对产物的合成不利什么是临界氧浓度和氧的满足度？临界氧浓度：是不影响菌的呼吸所允许的最低氧浓度。氧的满足度：实际溶解氧浓度与临界氧浓度之比。46、合适溶解氧选择的原则？如果要使菌体快速生长繁殖（如发酵前期），则应达到临界氧浓度；如果要促进产物的合成，则应根据生产的目的不同，使溶解氧控制在最适浓度（不同的满足度）47、发酵液中的溶解氧如何控制？(1)供氧方面：=1\*GB3①增加空气中氧的含量，使氧分压增加，进行富氧通气=2\*GB3②提高罐压=3\*GB3③改变通气速=4\*GB3④增加搅拌速度(2)需氧方面：=1\*GB3①调整养料的浓度=2\*GB3②调节控制温度48、泡沫对发酵有何影响？(1)降低了发酵罐的装液系数(2)增加了菌群的非均一性(3)增加了污染杂菌的机会(4)导致产物的损失49、发酵过程中如何控制泡沫的产生？常用的消泡剂有哪些？(1)泡沫的控制：机械消泡；化学消泡（消泡机理：=1\*GB3①降低泡沫的机械强度，使泡沫破裂=2\*GB3②降低液膜的表面黏度，使液膜的液体流失，导致泡沫破裂）(2)消泡剂：=1\*GB3①天然油脂---常用豆油、玉米油、米糠油（能兼作碳源）=2\*GB3②聚醚类---聚氧丙烯甘油（GP）、聚氧乙烯氧丙烯甘油（GPE）=3\*GB3③高级醇类---十八醇=4\*GB3④硅酮类--主要是聚二甲基硅氧烷及其衍生物50、何为染菌？可造成什么后果？如何防止染菌？所谓染菌：是指在发酵培养基中侵入了有碍生产的其它微生物。染菌的结果：轻者影响产量或质量，重者可能导致倒罐，甚至停产，造成原料、人力和设备动力的浪费。防止染菌要点：（1）空气系统（提高空压机进口空气的洁净度、防止空气带油、水及过滤器失效。）（2）设备（3）工艺操作（①空罐准备②实罐灭菌③连消④补料⑤种子⑥无菌试验51、染菌通常通过哪3个途径发现？无菌试验的方法有哪些？（1）无菌试验、发酵液直接镜检、发酵液的生化分析。其中无菌试验是判断染菌的主要依据。（2）无菌试验方法有双碟培养、斜面培养、肉汤培养等，其中以双碟和肉汤培养为主。52、发酵过程中如出现噬菌体污染，发酵异常现象体现在哪些方面？噬菌体污染后可以观察到糖消耗减慢，pH异常变化，产气减少，发酵稀薄，继之活的生产菌减少53、如何防止噬菌体的污染？（1）防止噬菌体入侵和蔓延（2）选用抗噬菌体突变株（3）使用抑制噬菌体复制的化学药物54、发酵终点放罐时间的确定取决于哪些因素？(1)经济因素-------(2)产品质量因素----------(3)特殊因素55、生产率、得率、发酵系数有何不同？生产率（Kg/m•h）得率（kg产物/kg基质）发酵系数（kg产物/罐容积m•发酵周期）56、发酵按不同的分式可分为哪些类型(1)根据微生物对氧的需求：好氧性发酵，厌气性发酵(2)按发酵培养基物理状态分：固体发酵(薄层发酵、厚层发酵)，液体发酵(表面培养法、深层培养法)57、液体深层发酵有哪些优点？(1)液体悬浮状态是多数微生物的最适生长环境。(2)在液体中，菌体及其底物、产物（包括热）易于扩散，使发酵可在均质或拟均质条件下进行。(3)液体输送方便，易于机械化操作。(4)厂房面积小，生产效率高，易进行自动化控制，产品质量稳定。(5)产品易于提取、精制58、发酵按操作方式的不同可分为哪几类？有何应用？(1)分批操作：由于操作相对较易，目前仍是发酵工业的主要方式(2)补料分批操作：=1\*GB3①细胞的高密度培养=2\*GB3②发生底物抑制的过程=3\*GB3③分解代谢物阻遏=4\*GB3④营养缺陷菌株的培养=5\*GB3⑤前体的补充(3)连续操作：=1\*GB3①细胞的生产=2\*GB3②代谢产物的生产=3\*GB3③细胞生理特性的研究=4\*GB3④发酵动力学研究=5\*GB3⑤培养基的改进59、发酵动力学主要是研究内容是什么？研究的重要方法是什么？研究的最终目的是什么？(1)研究内容包括----了解发酵过程中菌体生长速率、基质消耗速率和产物生产速率的相互关系，环境因素对三者的影响，以及影响其反应速率的条件。(2)研究的重要方法是----建立数学模型定量地描述发酵过程中细胞生长速率、基质利用速率和产物生成速率等因素的变化。(3)研究的最终目的是-----对发酵过程进行有效控制，从而提高产品的产率及降低生产成本。60、建立数学模型的一般原则是什么？(1)明确建立模型的目的：除为了深入研究微生物生长这一复杂现象外，多数是为了设计微生物反应器、探索最优操作条件，或者对反应过程进行最优控制(2)明确建立模型的假设，从而明确模型的适用范围；(3)模型中所含的参数，最好能分别通过实验测定；(4)模型应尽量简单。61、什么是代谢产物生成速率及比代谢产物生成速率？(1)代谢产物生成速率---单位体积培养液中单位时间内的产物生成量。rp(g/L·h)(2)比代谢产物生成速率---相对于单位质量干菌体在单位时间内的代谢产物生成量。Qp(g/g·h)62、代谢产物合成的动力学类型可分为哪三种类型？类型Ⅰ：生长关联型类型Ⅱ：部分生长关联型类型Ⅲ：非生长关联型63、微生物工程下游工程的特点是什么？(1)发酵液是复杂的多相系统(2)所需产物在培养液中浓度较低(3)普遍存在下游工程代价高，回收率较低等问题64、微生物工程下游工程的一般程序是什么？65、发酵液预处理和过滤的目的是什么？高价无机离子和可溶性杂蛋白的去除方法是什么？（2）发酵液的预处理目的：改变发酵液的物理性质，加快悬浮液中固形物沉降的速度；尽可能使产物转入便于以后处理的相中；能够除去部分杂质。（2）高价无机离子的去除：钙离子的去除：常用草酸；镁离子的去除：常用三聚磷酸钠；铁离子的去除：常用黄血盐与铁离子形成普鲁氏蓝沉淀（3）可溶性杂蛋白的去除：沉淀法，变性法，吸附法66、提高发酵液过滤性能的方法有哪些？(1)加助滤剂-------(2)添加填充凝固剂-------(3)酶解法67、细胞破碎的方法有哪些？(1)高压匀浆法(2)高速球磨法(3)超声波法(4)酶解法(5)渗透压冲击法(6)反复冻结-融化法常用的沉淀方法有哪些？各自的原理是什么？(1)盐析原理——Cohn方程S---离子强度为I时的蛋白溶解度(g/L);S0---纯溶剂（即I=0）时蛋白的溶解度；Ks---盐析常数，与温度和pH无关；I---离子强度(2)等电点沉淀法原理：利用两性电解质在电中性时溶解度最低(3)有机溶剂沉淀法原理：许多有机溶剂如丙酮、乙醇、甲醇等能使溶于水的小分子生物物质以及核酸、多糖、蛋白质等生物大分子发生沉淀作用。这种沉淀作用是多种效应的结果，但主要作用是降低水溶液的介电常数。(4)非离子型多聚物沉淀法机制：可能降低生物大分子水化度，与大分子发生共沉作用；与生物大分子形成复合物；或通过空间位置排斥，使液体中的微粒被迫聚集而沉淀。(5)聚电解质沉淀法原理：可沉淀蛋白，作用方式类似于絮凝剂，兼有一定的盐析和水化作用69、溶剂萃取原理是什么？萃取剂和萃取液有何不同溶剂萃取原理——分配定律：溶剂萃取法是以分配定律为基础的，即利用各种物质在不同溶剂中具有不同的溶解度的原理，达到将不同物质分离纯化的目的。用于进行萃取的溶剂称为萃取剂，经萃取后含有溶质的萃取剂称为萃取液70、在抗生素工业中常用的萃取剂有哪些？乙酸乙酯----------乙酸丁酯-------------丁醇71、什么是乳化？乳化现象会造成什么后果？如何去乳化？乳化：在萃取过程中，经常会出现一种液体分散到另一种本不相溶的液体中，即乳化现象。后果：乳化现象会造成有机溶剂相和水相分层困难，出现两种夹带现象：=1\*GB3①发酵液提取废液中夹带有机溶剂微粒，导致产品损失；=2\*GB3②有机溶剂相中夹带发酵液微粒，会将杂质带入产品中。72、什么是逆流萃取？料液移动的方向和萃取剂移动的方向相反73、什么是离子交换法？离子交换剂由哪几部分组成？离子交换剂可分为哪两类？了解离子交换树脂的命名。离子交换的一般过程。(1)离子交换法：利用溶液中带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作方法。(2)离子交换剂：由惰性的不溶性载体、功能基团和平衡离子组成。(=1\*GB3①阳离子交换剂：平衡离子带正电荷=2\*GB3②阴离子交换剂：平衡离子带负电荷)(3)离子交换树脂的命名：强酸类1～100号；弱酸类101～200；强碱类201～300；弱碱类301~400；中强酸类401～500。交联度：是合成载体骨架时交联剂重量的百分数，用“×”将树脂编号与交联度分开。弱酸101×4其交联度为4％。国内常用树脂命名：724；732；71774、什么是凝胶层析？原理是什么？了解葡聚糖凝胶性能与编号的关系。（1）凝胶层析：将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相，由于各组分流经体积的差异，使不同分子量的组分得以分离的层析方法。（2）原理：当具有一定分子量分布的高聚物溶液从柱中通过时，较小的分子在柱中停留时间比大分子停留的时间要长，样品各组分即按分子大小顺序而分开，最先淋出的是最大的分子。葡聚糖凝胶性能与编号的关系：75、结晶的过程分哪几步？结晶的方法有哪些？影响结晶的因素有哪些？工业上获得更纯更大晶体的方法是什么？(1)结晶过程：=1\*GB3①形成过饱和溶液=2\*GB3②晶核形成=3\*GB3③晶体生长(2)结晶方法：=1\*GB3①蒸发法=2\*GB3②温度诱导法=3\*GB3③盐析结晶法=4\*GB3④透析结晶法=5\*GB3⑤等电点法=6\*GB3⑥化学反应结晶法(3)影响结晶的因素：=1\*GB3①样品纯度=2\*GB3②溶液的饱和度=3\*GB3③溶剂的影响(4)提高晶体质量的途径：=1\*GB3①晶体大小(过饱和度，温度，搅拌速度，晶种等)=2\*GB3②晶体形状(选择不同的溶剂，控制过饱和度，结晶温度，调节溶液的pH，有目的地加入某种能改变晶形的杂质等)=3\*GB3③晶体纯度(重结晶：即将晶体用合适的溶剂溶解再次结晶)76、膜过滤有何特点？膜过滤可分为哪几种方式，适用范围如何？特点：=1\*GB3①无相变、低能耗=2\*GB3②高效率、污染小=3\*GB3③工艺简单、操作方便=4\*GB3④便于与其它技术集成微滤0.1～10m：细菌、发酵细胞、蛋白等超滤0.005～0.1m：蛋白、多糖、大分子纳滤0.0005～0.005m：低聚糖、多价离子反渗透0.0001～0.001m：电解质、大于100Da的有机溶质77、何为终端过滤、错流过滤？有何特点？终端过滤：污染严重的为终端过滤。错流过滤：污染较轻的为错流过滤错流过滤的优点：=1\*GB3①便于连续化操作过程中控制循环比；=2\*GB3②流体流动平行于过滤表面，产生的表面剪切力带走膜表面的沉积物，防止污染层积累，使之处于动态平衡，从而有效地改善液体分离过程，使过滤操作可以在较长的时间内连续进行；=3\*GB3③错流过滤所产生的流体剪切力和惯性举力能促进膜表面的溶质向流体主体的反向运动，提高了过滤速度。78、抗生素的定义、效价单位的定义(1)抗生素是生物（微生物、动物、植物）在其生命活动过程中所产生的或由其它方法获得的，能在低微浓度下有选择性地抑制或影响其它生物机能的有机物质。(2)效价单位：每毫升或每毫克中所含有某种抗生素的有效成分的多少。79、图示生物合成抗生素的生产工艺流程80、什么是抗生素的半合成法？目的是什么？(1)半化学合成法：用化学或生物化学的方法改变已知抗生素的化学结构，或引入特定的功能基团而获得的新抗生素品种或其衍生物的总称。(2)半合成抗生素的目的：=1\*GB3①增强抗菌力=2\*GB3②扩大抗菌谱；=3\*GB3③对耐药菌有效；=4\*GB3④便于口服；=5\*GB3⑤降低毒副作用反应或弥补其它缺陷目的。81、目前生产青霉素的菌种是什么？为了获得青霉素G，一般在发酵液中加什么？如何从发酵液中把抗生素分离出来？(1)产黄青霉素--------(2)苯乙酸前体(3)青霉素的提取和精制：=1\*GB3①过滤和预处理=2\*GB3②萃取和精制=3\*GB3③结晶82、目前国际上常用于抗生素效价测定的方法是什么？“管碟扩散法”为国际上常用的方法83、谷氨酸积累机理是什么？在发酵过程中如何控制发馈调节的发生？(1)谷氨酸积累机理：谷氨酸产生菌丧失或仅有微弱的-酮戊二酸脱氢酶活力，使-酮戊二酸不能继续氧化；但谷氨酸脱氢酶活力很强，同时NADPH2再氧化能力弱，这样就使-酮戊二酸到琥珀酸的过程受阻；在有过量铵离子存在时，-酮戊二酸经氧化还原共轭的氨基化反应而生成谷氨酸。(2)控制细胞膜的通透性：谷氨酸发酵的关键在于发酵培养期间谷氨酸生产菌细胞膜结构与功能上的特异性变化，使细胞膜转变成有利于谷氨酸向膜外渗透的样式，即完成谷氨酸非积累型细胞向谷氨酸积累型细胞的转变。这样，由于终产物谷氨酸不断地排出细胞外，使细胞内的谷氨酸不能积累到引起反馈调节的浓度，谷氨酸就会在细胞内继续不断地被优先合成。84、常用于谷氨酸提取的方法？图示谷氨酸制味精的工艺流程。85、黑曲霉生物合成柠檬酸的主要途径是什么？图示柠檬酸深层发酵法的生产工艺流程。生物合成途径是：葡萄糖经EMP或HMP降解，形成丙酮酸；丙酮酸一方向氧化脱羧生成乙酰COA、另一方面经CO2固定羧化成草酰乙酸：然后草酰乙酸与乙酰COA缩合生成柠檬酸。86、什么是啤酒？按生产方式可分为哪三类？(1)啤酒以大麦芽﹑酒花﹑水为主要原料﹐经酵母发酵作用酿制而成的饱含二氧化碳的低酒精度酒。(2)生产方式分类：鲜啤酒，熟啤酒，生啤酒87、发酵度与发酵速度的定义，简述啤酒的生产工艺流程(1)发酵度：酵母对麦芽汁的发酵能力。(2)发酵速度：产生二氧化碳的量。我国啤酒生产常的酵母菌是哪一种？生产啤酒的主要原料是什么？各起什么作用？(1)我国全部采用下面酵母发酵啤酒(2)酿造啤酒的原料：=1\*GB3①大麦：大麦是啤酒生产的主要原料，生产中是先将大麦制成麦芽，再用来酿造啤酒=2\*GB3②酒花：赋予啤酒香味和爽口的苦味，增进啤酒的泡沫持久性和稳定性，与麦汁共沸时能促进蛋白质凝固，利于澄清，并能增高麦汁和啤酒的防腐能力。=3\*GB3③水：糖化，洗糟，啤酒稀释=4\*GB3④辅助原料：以价廉而富含淀粉的谷物为麦芽辅助原料，可降低原料成本和吨酒粮耗；使用糖类或糖浆为辅料，可以节省糖化设备的容量，同时可以调节麦汁中糖的比例，提高啤酒发酵度；使用辅助原料，可以降低麦汁中蛋白质和多酚类物质的含量，降低啤酒色度，改善啤酒风味和非生物稳定性；使用部分辅助原料(如小麦)可以增加啤酒中糖蛋白的含量，改进啤酒的泡沫性能。绪论1680年列文虎克制成显微镜───证明了微生物的存在。1857年，巴斯德（LouisPasteur）微生物之父证明了酒精是由活的酵母发酵引起的。并提出了著名的发酵理论：一切发酵过程都是微生物作用的结果。1897年德国化学家毕希纳发现磨碎的酵母仍使糖发酵形成酒精───酶1905年，柯赫建立微生物纯培养技术，为微生物学的发展奠定了基础。科赫的固体培养基也是微生物学研究史上的一大突破。第一章生产菌种的筛选1、工业化菌种的要求有哪些？①遗传性能要相对稳定，不易变异退化；②能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物；③抗病毒能力强，不易感染它种微生物或噬菌体；④产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，包括抗生素、激素和毒素等，保证安全）；⑤有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强；⑥生产特性要符合工艺要求（如生长速度和反应速度较快，发酵周期短等）。⑦培养和发酵条件温和（糖浓度、温度、pH、溶解氧、渗透压等）2.在工业生产中常用的微生物主要有细菌、酵母菌、霉菌和放线菌3、自然界分离微生物的一般操作步骤？从环境中分离目的微生物时，为何一定要进行富集培养？样品的采集-预处理—培养—培养—菌落的选择—出筛—复筛—性能的鉴定—菌种保藏富集培养的原因：自然界中目的微生物含量很少，非目的微生物种类繁多，进行富集培养，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，使筛选变得可能。4.每克土壤的含菌量大体上有一个十倍系列的递减规律：

细菌（～108）＞放线菌（～107）＞霉菌（～106）＞酵母菌（～105）＞藻类（～104）＞原生动物（～103）第二章微生物的代谢调节和控制1、酶活性调节的反馈抑制类型和抑制机制。反馈抑制——主要表现在某代谢途径的末端产物过量时可反过来直接抑制该途径中第一个酶的活性，促使整个反应过程减慢或停止，从而避免了末端产物的过多累积。主要表现在氨基酸、核苷酸合成途径中。特点：作用直接、效果快速、末端产物浓度降低时又可解除同功酶的主要功能在于其代谢调节。在一个分支代谢途径中，如果在分支点以前的一个较早的反应是由几个同功酶所催化时，则分支代谢的几个最终产物往往分别对这几个同功酶发生抑制作用协同反馈抑制：指分支代谢途径中的几个末端产物同时过量时才能抑制共同途径中的第一个酶的一种反馈调节方式。③增效反馈抑制：系指两种末端产物同时存在时，可以起着比一种末端产物大得多的反馈抑制作用。累积反馈抑制：每一分支途径的末端产物按一定百分率单独抑制共同途径中前面的酶，所以当几种末端产物共同存在时，它们的抑制作用是累积的。⑤顺序反馈抑制：当E过多时，可抑制C→D，这时由于C的浓度过大而促使反应向F、G方向进行，结果又造成了另一末端产物G浓度的增高。由于G过多就抑制了C→F，结果造成C的浓度进一步增高。C过多又对A→B间的酶发生抑制，从而达到了反馈抑制的效果。这种通过逐步有顺序的方式达到的调节，称为顺序反馈抑制联合激活或抑制调节一种中间产物参与2个独立的代谢过程，其浓度影响2个代谢，存在激活抑制的联合调节。2、大肠杆菌的乳糖操纵子模型中包含几部分？结构基因、启动基因、操纵基因、调节基因3、微生物细胞初级代谢的调节有哪两种类型？4、次级代谢产物、初级代谢产物初级代谢产物是指微生物通过代谢活动产生的，生长和繁殖所必需的物质，如蛋白质、核酸等。次级代谢产物是指微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该微生物无明显生理功能，或并非是微生物生长和繁殖所必需的物质。5、酶的诱导和阻遏诱导(induction)：是酶促分解底物或产物诱使微生物细胞合成分解代谢途径中有关酶的过程。根据酶的生成与环境中是否存在酶的底物或其有关物，可把酶划分成组成酶和诱导酶两类。组成酶：不依赖酶底物而合成的酶，如：EMP途径的一些酶。微生物细胞内一直存在，合成是受遗传物质控制。诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似物通过诱导作用而临时合成的一类酶。如E.coli在含乳糖的培养基中合成β-半乳糖苷酶和半乳糖苷渗透酶能促进诱导酶产生的物质称为诱导物，它可以是该酶的底物，也可以是难以代谢的底物类似物或是底物的前体物质。酶的诱导合成类型同时诱导：即当诱导物加入后，微生物能同时或几乎同时诱导几种酶的合成，它主要存在于短的代谢途径中。例如，将乳糖加入到E．coli培养基中后，即可同时诱导出β-半乳糖苷透性酶、β-半乳糖苷酶和半乳糖苷转乙酰酶的合成；顺序诱导：即先合成能分解底物的酶，再依次合成分解各中间代谢物的酶，以达到对较复杂代谢途径的分段调节。（二）酶合成的阻遏阻遏（repression）：在微生物的代谢过程中，当代谢途径中某末端产物过量时，除可用前述的反馈抑制的方式来抑制该途径中关键酶的活性以减少末端产物的生成外，还可通过阻遏作用来阻碍代谢途径中包括关键酶在内的一系列酶的生物合成，从而更彻底地控制代谢和减少末端产物的合成。阻遏作用有利于生物体节省有限的养料和能量。阻遏的两种类型：1、末端产物阻遏末端产物阻遏（end-productrepression）指由某代谢途径末端产物的过量累积而引起的阻遏。对直线式反应途径来说，末端产物阻遏的情况较为简单，即产物作用于代谢途径中的各种酶，使之合成受阻遏，例如过量的精氨酸阻遏了参与合成精氨酸的许多酶的合成。2、分解代谢物阻遏分解代谢物阻遏（cataboliterepression）：指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。最早发现于大肠杆菌生长在含葡萄糖和乳糖的培养基时,葡萄糖分解代谢物阻遏乳糖分解酶而出现“二次生长（diauxicgrowth）”。分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。因此，分解代谢物的阻遏作用，就是指代谢反应链中，某些中间代谢物或末端代谢物的过量累积而阻遏代谢途径中一些酶合成的现象。第三章优良菌种的选育1、经常用于菌种的初筛的方法有哪些？各有什么特点？菌种选育中常用的三种培养基①初筛常用的方法：平皿快速检测法a.是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的“形态”变化。具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等。b.这些方法简单，快速，可大大提高筛选的效率。但缺点是较粗放，一般只能定性或半定量用；而且由于培养平皿上的条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液体培养的条件差别很大，有时会造成两者结果不一致。c.平皿快速检测法操作时应注意将培养的菌体充分分散，以形成单菌落，避免多菌株混杂一起，引起“形态”大小测定的偏差。1）纸片培养显色法：将饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片搁于培养皿中，将待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸上，保温培养形成分散的单菌落，菌落周围将会产生对应的颜色变化。从指示剂变色圈与菌落直径之比可以了解菌株的相对产量性状。指示剂可以是酸碱指示剂也可以是能与特定产物反应产生颜色的化合物。2）变色圈法：将指示剂直接掺入固体培养基中，进行待筛选菌悬液的单菌落培养，或将指示剂喷洒在已培养成分散单菌落的固体培养基表面，在菌落周围形成变色圈。如在含淀粉的平皿中涂布一定浓度的产淀粉酶菌株的菌悬液，使其呈单菌落，然后喷上稀碘液，发生显色反应。变色圈越大，说明菌落产酶的能力越强。3）透明圈法:在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培养基背景。接种后待筛选的菌落周围会形成透明圈，透明圈的大小反映了菌落利用此物质的能力。在培养基中掺入可溶性淀粉、酪素或CaCO3可以分别用于检测菌株产淀粉酶、产蛋白酶或产酸能力的大小。4）生长圈法:利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，若待分离的菌在缺乏上述营养物的条件下，能合成该营养物，或能分泌酶将该营养物的前体转化成营养物，那么，在这些菌的周围就会有工具菌生长，形成环绕菌落生长的生长圈。该法常用来选育氨基酸、核苷酸和维生素的生产菌。工具菌往往都是对应的营养缺陷型菌株。5）抑制圈法：待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制工具菌生长的物质，或能分泌某种酶并将无毒的物质水解成对工具菌有毒的物质，从而在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈。菌种选育中常用的三种培养基：1）基本培养基（MM)：仅能满足某微生物的野生型或原养型菌株生长需要的最低成分组合培养基。不同微生物的基本培养基成分差别比较大。［-］2）完全培养基(CM)：可满足某种微生物一切营养缺陷型菌株营养需要的培养基。通过将富含各种氨基酸、维生素、碱基的天然物质（如牛肉膏、蛋白胨、麦芽汁）加入基本培养基中制成。［+］3）补充培养基(SM)：只能满足某种微生物的一种或几种营养缺陷型及野生型菌株生长需要的培养基。一般由基本培养基加入相应营养成分构成。2、最为常用的物理诱变剂是什么？紫外诱变的有效波长范围及注意事项？物理诱变剂：射线如紫外线、X—射线、γ—射线，快中子；紫外线诱变一般采用15W紫外线杀菌灯，波长为253.7nm．灯与处理物的距离为15～30cm，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量死亡率控制在70～80%为宜。被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个／ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～107个／ml。由于紫外线穿透力不强，要求照射液不要太深，约0.5～1.0cm厚，同时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使照射均匀。由于紫外线照射后有光复活效应，所以照射时和照射后的处理应在红灯下进行。3、诱变育种？回复突变？诱变育种：利用各种诱变剂（能够提高生物体突变频率的物质，如物理因素和化学试剂）处理微生物细胞，提高基因突变效率，再通过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降的现象。4、自然选育的特点？优点：简单易行，自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。缺点：效率低，进展慢，不能满足育种工作要求；发生负向突变，表现为菌株的衰退和生产质量的下降的几率更高。5、选育发酵高产菌种的方法包括基因突变育种和基因重组育种,其中后者包括基因工程育种、杂交育种、和原生质体融合育种。第四章菌种的保藏及种子的扩大培养1、各种菌种保藏方法的保藏原理、适用范围和时间长短。①定期移植法：将斜面培养、液体培养或穿刺培养好的菌种，置于4-6℃冰箱保存，定期移植到新的培养基上生长后继续保藏。一般保存期3-6个月。保存的温度和时间各菌种不一②隔绝空气法该法是定期移植法的辅助方法。用170℃下灭菌1-2h的液体石蜡封住半固体穿刺培养物，在4-5℃冰箱中保藏，保存期6-12个月。适用于各种好气性、且不能以石蜡为碳源的菌种，如固氮菌、分枝杆菌、沙门氏菌、毛霉、根霉等。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。原理：利用低温、缺氧抑制微生物代谢，推迟细胞老化，防止培养基水分蒸发，从而延长微生物的寿命。③沙管保藏法、土壤保藏法原理：利用干燥、低温、隔氧、无营养物的条件保藏菌种。土壤是自然界微生物的共同活动场所，土壤颗粒对微生物具有一定的保护作用。保藏期：4-5℃冰箱保藏，也可常温下保存，时间可达数年，甚至数十年。特点：保藏的效果较好，制作也简单，比液体石蜡法保藏时间长。适用菌种：产孢子的丝状真菌和放线菌以及产芽孢的细菌。方法：取河沙过24目筛，用10~20%的盐酸浸泡除去有机质，洗涤，烘干，分装入安瓿管，加塞灭菌。需要保藏的菌株先用斜面培养基培养，再用无菌水制成细胞或孢子悬液，将10滴悬液注入装有洗净、灭菌河沙的沙管内，使细胞或孢子吸附在沙上，放到干燥器中吸干沙中的水分，将干燥后的沙管用火焰熔封管口。可以室温或低温保藏。土壤法以土壤代替河沙，不需酸洗，经风干、粉碎、过24目筛，分装灭菌后，同上制备。以上两种方法统称为沙土管法。④蒸馏水悬浮法这是最简单的保藏方法。每个试管中装5毫升灭菌的无菌水，用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞，接入蒸馏水中并使之悬浮，试管用无菌的橡皮塞塞紧，放置10℃低温保藏。需用时，可从管内移出一环接到培养基上，而原来的管加塞后仍可继续保藏。该法为菌种创造了一个无营养的环境，也是一种保藏菌种的好方法，保藏期为1年以上。适用菌种：该法适宜保藏诡谲棒状杆菌（Cornebacteriuminsidiosum)、根瘤病土壤杆菌（Agrobacteriumtumefaciens)、假单孢菌（Pseudomonassp.)等。也有人将其用于酵母、丝状真菌、及肠道细菌的保藏。⑤麸皮保藏法麸皮保藏法（或称曲法保藏）常用于放线菌和霉菌的保藏。我国制曲已有悠久历史，曲既是酿造的酶制剂，又是保藏酿造用微生物的一种方式。将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其它培养基成分以一定的比例拌匀，加水或培养液与麸皮的比例为1:0.8或1:1或1:1.5，原则是按照不同菌种对水分要求不同而定。将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器中，装入的麸皮应保持疏松，不要紧压。高温灭菌后，将菌种接入在适宜温度下培养，直至形成孢子。再放在干燥器中干燥后，20℃以下温度保藏。也可将小管用火焰熔封，保存期可达1-3年。该法操作简单，菌种保藏时间长，不易退化。工厂中经常采用。6.真空冷冻干燥法利用低温、干燥和隔绝空气等几个保藏菌种的重要方法的综合作用。该法是将菌液在冻结状态下升华其中水分，最后获得干燥的菌体样品。它同时具备干燥、低温和缺氧的菌种保藏条件，所以，可使微生物菌种得到较长时间的保存。冻干的菌种密封在较小的安瓿管中，避免了保藏期间的污染，也便于大量保藏。它是目前被广泛推崇的菌种保藏方法。但是，该法操作相对繁琐，技术要求较高。根据文献记载，除不生孢子只产菌丝体的丝状真菌不宜用此法外，其它多数微生物，如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等都能冻干保藏。许多菌种用此法可保藏10年以上。具体步骤：①预先将安瓿管用2%盐酸浸泡，洗净、烘干后，加入菌种编号标签纸条，加棉塞，湿热灭菌后烘干。微生物斜面培养至稳定期（最好形成孢子），加入保护剂制成细胞悬液。液体培养的菌体最好用离心法除去培养基后加保护剂制成细胞悬液。在冷冻干燥脱水的过程中，保护剂起到稳定细胞膜的作用，即能推迟或逆转膜成分的变性，同时，又可以使细胞免于冰晶损伤而死亡。保护剂还在菌种保藏和复苏过程中起稳定细胞的作用。保护剂一般为脱脂牛奶或马血清等。②悬液的细胞浓度以108~1010个/ml为宜。将2~3ml保护剂加入斜面内，用接种针轻刮菌苔，注意不使悬液中带入培养基，也不能有过多的气泡。随即将悬液分装安瓿管。为避免保护剂或带入的培养基中某些成分或产物的影响，在1小时内必须将分装好的安瓿管放到-25~-40℃的低温冰箱或冻干装置中预冻。预冻的目的是使水分在真空干燥时直接由冰晶升华为水蒸汽。预冻一定要彻底，否则，干燥过程中一部分冰会融化而产生泡沫或氧化等副作用，或使干燥后不能形成易溶的多孔状菌块，而变成不易溶解的干膜状菌体。预冻的温度和时间很重要。预冻温度一般应在-30℃以下。在0~-10℃范围内冻结，所形成的冰晶颗粒较大，易造成细胞损伤。-30℃下冻结，冰晶颗粒细小，对细胞损伤小。③待结冰坚硬后（约需0.5~1小时），可开始真空干燥。要求真空度在15分钟内达到0.5mmHg，并逐渐达到0.2~0.1mmHg。在0.2mmHg真空度后水分大量升华，此时也可以略加温，以加快样品中水分升华，但需注意不能超过30℃。抽真空过程中样品应始终保持冷冻状态。当样品基本干燥后，样品温度上升，加速了样品残留水分的蒸发。少量样品经4小时左右便可以干燥。当真空度达到0.01mmHg时继续抽几分钟后，一边抽气，一边即可用喷灯熔封安碚管口。然后以高频电火花检查各安瓿的真空情况，管内呈灰蓝色光表示已达真空。检查时电火花应射向安瓿的上半部，切勿直射样品。制成的安瓿管可在4℃冰箱或室温下保藏。⑦液氮超低温保藏法这是鉴于有些微生物不宜采用冷冻干燥法，而其它方法又不能长期保藏，根据液氮保存精子和血液等的启发而发展起来的菌种保藏法。几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液氮超低温保藏。只有少量对低温损伤敏感的微生物例外。液氮保藏的另一大优点是可利用各种培养形式的微生物进行保藏，不论孢子或菌体、液体培养物或固体培养物均可使用该法。液氮超低温保藏技术已被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一，也是适用范围最广的微生物保藏法。但缺点是保藏费用高，仅用于保存经济价值高、容易变异，或其他方法不能长期保存的菌种。液氮超低温保藏过程是将菌种悬浮液封存于圆底安瓿管或塑料的液氮保藏管（材料应能耐受较大温差骤然变化）内，放到-150~-196℃的液氮罐或液氮冰箱内保藏。操作过程中一大原则是“慢冻快融”。为了减轻冷冻损伤程度，可采用保护剂。液氮保藏一般选用渗透性强的保护剂，如甘油和二甲亚砜。它们能迅速透过细胞膜，吸住水分子，保护细胞不致大量失水，延迟或逆转细胞膜成分的变性并使冰点下降。通常将菌种悬浮在10%（V/V）甘油蒸馏水或10%（V/V）二甲亚砜蒸馏水保护剂中。孢子或菌体悬液的浓度大于108个/ml为好。事先，保护剂甘油应在121℃，蒸汽灭菌15分钟。二甲亚砜应过滤除菌。⑧其他冷冻保藏技术(-20℃)（1）普通冷冻保藏技术(-20℃)将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接到试管或指管内，然后贮藏于-20℃的普通冰箱中。也可将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰箱中保存。用此方法可以维持若干微生物的活力1—2年。应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封。这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏。超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60℃以下进行保藏。在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是：1．离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞；2．用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；3．加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜；4．混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温冰箱中保藏。如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含10％甘油的新配制液体培养基洗涤收获。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2℃／min。若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。⑨基因工程菌的保藏由载体质粒等携带的外源DNA片段通常是遗传不稳定的、且很易丢失其外源质粒复制子。质粒基因通常为宿主细胞生长非必需，且一般情况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度会加快。当培养基中加入抗生素时，抗生素提供了一个有利于携带质粒的细胞群体的极为有用的生长选择压力。而且抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。所以建议基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂的培养基中。2、接种量的概念？移入种子的体积接种量＝—————————接种后培养液的体积3、发酵级数及特点？种子罐级数一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数；种子罐级数越少，越有利于简化工艺，便于控制，减少染菌；减少消毒及值班工作量，减少因种子罐生长异常而造成的发酵波动。级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2-4级。接种方式：一级种子罐：火圈保护接种法和压差法；二级种子罐：压差法；发酵级数的确定①种子的性质（如菌种传代后的稳定性）；②孢子瓶中孢子的密度（密度大则级数少）；③孢子发芽及菌丝繁殖速度（生长特性）；④发酵罐中种子的最低接种量；⑤种子罐与发酵罐的容积比（发酵规模）；其中菌种的发生长特性影响最大放线菌（生产抗生素）三级放大，（其中链霉素须四级扩大）；细菌生长较快，用二级放大培养（斜面菌种→一级种子摇床培养→二级种子罐培养→发酵罐）。还要随着工艺条件的改变作适当的调整。4、扩大培养时接种的时机选择？5、什么是种子的扩大培养？种子扩大培养的目的、要求及一般步骤？种子扩大培养:种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种的过程。这些纯种培养物称为种子。步骤：休眠孢子→母斜面活化→摇瓶种子或茄子瓶斜面或固体培养基孢子→一级种子罐→二级种子罐→发酵罐种子扩培的目的：接种量的需要，菌种的驯化，缩短发酵时间、保证生产水平

种子的要求：总量及浓度能满足要求，生理状况稳定，个体与群体，活力强，移种至发酵后，能够迅速生长，无杂菌污染6、微生物发酵的种子应具备哪些条件？①菌种细胞的生长活力强，转种至发酵罐后能迅速生长，延迟期较短。②菌种生理状态稳定，如菌体形态、菌丝生长速率和种子培养液的特性等符合要求；③菌体浓度及总量能满足大容量发酵罐接种量的要求，一般接种量大，发酵时间较短；④无杂菌污染，保证纯种发酵；⑤菌种经驯化后适应性更强，能保持稳定的生产能力。7、导致菌种衰退的原因有哪些？变异衰退；分离现象；自然衰老第五章培养基的制备1、培养基及其分类和组成？微生物的培养基根据生产用途主要分为哪几类？①天然培养基：是采用化学成分还不清楚或还不恒定的各种植物和动物组织或微生物的浸出物、水解液等物质(例如牛肉膏、酵母膏、麦芽汁、蛋白胨等)制成的。适合于除自养菌外各类微生物生长。②合成培养基：用化学成分和数量完全了解的物质配制而成的。成分精确，重复性强，可以减少不能控制的因素；但由于培养基营养单一，一般微生物在合成培养基上生长较慢，有些微生物营养要求复杂，在合成培养基上不能生长，且价格较高。适于在实验室范围作有关营养、代谢、分类鉴定、生物测定及选育菌种、遗传分析等定量研究工作。③半合成培养基：多数培养基配制是采用一部分天然有机物作碳源、氮源和生长因子的来源，再适当加入一些化学药品以补充无机盐成分，使其更能充分满足微生物对营养的需要。大多数微生物都能在此培养基上生长繁殖。因此，在微生物工业生产上和试验研究中被广泛使用。工业发酵中培养基往往依据生产流程和作用分为：斜面培养基；种子培养基；发酵培养基2、发酵培养基的特点和要求是什么？（培养基设计）①提供必要的营养成分：培养基成分必须满足细胞生长，代谢活动和合成产物所需的基本要求；还要注意原料价格低廉，质量稳定，取材容易。而且还要根据产物合成的特点来设计培养基；对菌体生长与产物相偶联的发酵类型，充分满足细胞生长繁殖的培养基就能获得最大的产物。对于生产氨基酸等含氮的化合物时，它的发酵培养基除供给充足的碳源物质外，还应该添加足够的铵盐或尿素等氮素化合物。②配制合适的浓度：可以从发酵动力学有关生长、产物合成和基质利用物料平衡的关系中大致推算所需原料或大致计算出所需主要原料的需要量。还要注意主成分与其他成分的配比，并且保持适当的粘度和渗透压，以保证灭菌质量。③控制合适的pH：微生物的生长繁殖或产物的合成往往需要—定的pH环境，在最适pH值下有利于加快各种酶的反应。因此在整个发酵过程中应使培养基的pH适合于微生物生长或产物合成所需。④避免产生微生物不能利用的物质或形成沉淀葡萄糖与铵盐或氨基酸的氨基在灭菌高温下作用形成深褐色物质。这种物质不被微生物利用。因此这两类营养物不宜直接配在一起进行灭菌，而应采用分开灭菌后再加入发酵罐内。硫酸铵中的SO42-与钙盐易形成难溶的硫酸钙，因此二者也不宜直接配成培养基。⑤注意代谢调节物的影响：有些物质存在于培养基中往往能明显地促进或抑制发酵产物的形成。前体物质;诱导剂;阻遏物;抑制剂;金属离子3、培养基中各种成分的作用？(1)碳源功能①构成菌体成分的重要元素，②产生各种代谢产物和细胞内贮藏物质的主要原料，③同时又是化能异养型微生物的能量来源。(2)氮源功能①为细胞生长和产物合成提供氮元素。氮是构成微生物细胞蛋白质和核酸的主要元素，而蛋白质和核酸是微生物原生质的主要组成部分。②氮素一般不提供能量，但硝化细菌却能利用氨作为氮源和能源。③就某一类微生物而言，由于其合成能力的差异，对氮营养的需要也有很大区别。(3)无机盐类功能和微量元素①构成菌体成分；②作为酶活性基的组成部分或维持酶的活性；③调节渗透压、pH值、氧化还原电位等；④作为自养菌的能源。但不同菌种需求不同；同一微生物在不同生长阶段对这些物质的最适需求量也不同。（4）前体功能：指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构没有多大的变化，但产物的产量却因加入前体而有较大的提高。（5）促进剂和抑制剂促进剂：是一类刺激因子，指那些既不是营养物又不是前体，但却能提高产量的添加剂，这类物质加入或者可以影响微生物的正常代谢，或者促进中间代谢产物的积累，或者提高次级代谢产物的量。抑制剂：抑制剂会抑制某些合成其它产物的途径，同时会使另外一些代谢途径活跃，从而获得人们所需要的某种产物或使正常代谢的某一代谢中间物积累起来。（6）水①水是良好的溶剂，菌体所需要的营养物质都是溶解于水中被吸收的。所有的生化反应也都是在水溶液中进行的。②渗透、分泌、排泄等作用都是以水为媒介的；③水直接参与代谢作用中的许多反应。所以，水在生物化学反应中占有极为重要的地位。④水是热的良导体，比热高，能有效地吸收代谢过程中所放出的热，可调节细胞的温度，使细胞内温度不致骤然上升。（7）生长因子广义说，凡是微生物生长不可缺少的微量有机物质都称为生长因子(又称生长素)，包括氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等；狭义说，生长素仅指维生素。与微生物有关的维生素主要是B族维生素，这些维生素是各种酶的活性基的组成部分，没有它们，酶就不能活动。有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B族维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子。（8）酶制剂功能：①使培养基中大分子成分降解，便于微生物的利用；②降低培养基黏度和起泡能力（淀粉酶）③提高培养基成分利用率（9）酸和碱功能：调节培养基的pH。4、生长因子主要包括哪几类？生长因子的特点？(见上)包括氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等；狭义说，生长素仅指维生素。5、前体及使用方法？前体概念：是指当添加到发酵培养基中的某些化学物质基本上不改变其分子结构而直接进入产物中的小分子物质，从而在一定条件下控制产物的合成方向和提高产量。一般采用流加的方式6、产物抑制剂、功能及举例（酵母甘油生产）？产物促进剂？促进剂：是一类刺激因子，指那些既不是营养物又不是前体，但却能提高产量的添加剂，这类物质加入或者可以影响微生物的正常代谢，或者促进中间代谢产物的积累，或者提高次级代谢产物的量。抑制剂：抑制剂会抑制某些合成其它产物的途径，同时会使另外一些代谢途径活跃，从而获得人们所需要的某种产物或使正常代谢的某一代谢中间物积累起来。举例：酵母微生物发酵生产甘油中，亚硫酸氢钠与代谢过程中的乙醛生成加成物。反应式如下：这就使乙醇代谢途径中的乙醛不能成受氢体，而使NADH在细胞中积累，从而激活a-磷酸甘油脱氢酶的活性，使磷酸二羟基丙酮取代乙醛作为NADH的受氢体，而还原为a-磷酸甘油，其水解后即形成甘油7、常用的有机和无机氮源有哪些？功能？①无机氮源：铵盐、硝酸盐、氨水无机氮源的特点：Ａ.微生物对其吸收利用比有机氮快，所以也称速效氮。Ｂ.氨碱性强，易挥发，不能加热灭菌需过滤灭菌。Ｃ.利用无机氮时应注意引起的pH变化。②有机氮源：花生饼粉（peanuemeal）；黄豆饼粉(soybeanmeal)；棉子饼粉(cottonseedmeal)玉米麸质粉(cornglutenmeal)；鱼粉(fishmeal)；蛋白胨、酵母膏、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟等它们在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基酸，被菌体进一步分解代谢。玉米浆(cornsteepliquor)：是玉米淀粉生产中的副产物，其中固体物含量在50％。还含有有机酸、还原糖、磷、微量元素、生长素。由于玉米浆的来源不同，加工条件也不同，因此玉米浆成分有较大波动。有机氮源特点：一般无毒，可在培养基中使用较高浓度，但高浓度尿素使培养基中pH上升；含有丰富的蛋白质、多肽和游离的氨基酸；还含有少量的糖类、脂肪、无机盐、维生素及生长因子。有机氮源成分复杂，且来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响选择氮源时：有机氮源和无机氮源应当混合使用。早期：容易利用易同化的氮源—无机氮源；中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质工业生产上常用硫酸铵、尿素、氨水、豆饼粉、花生饼粉、麸皮等原料作氮源。8、常用的碳源有哪些？常用的糖类有哪些，各自有何特点？糖单糖：己糖寡糖：蔗糖、麦芽糖、棉子糖多糖：淀粉、纤维素、半纤维素、甲壳质和果胶质等，其中淀粉是大多数微生物都能利用的碳源。脂类有机酸：醋酸、乳酸、柠檬酸、丙酮酸、酒石酸等。低碳醇：碳酸气、石油、天然气、甲醇、乙醇等葡萄糖：是最易利用的糖，并且作为加速微生物生长的一种有效的糖。但过多的葡萄糖会过分加速菌体的呼吸，以致培养基中的溶解氧不能满足需要。糖蜜：是制糖厂生产糖时的结晶母液，是蔗糖厂的副产物。含有较丰富的糖、氨素、无机盐和维生素等，是微生物工业的价廉物美的原料。淀粉：一般要经菌体产生的胞外酶水解成单糖后再被吸收利用。可克服葡萄代谢过快的弊病。来源丰富，价格比较低廉。常用的为玉米淀粉、小麦淀粉和甘薯淀粉。油和脂肪：在微生物分泌的脂肪酶作用下水解为甘油和脂肪酸，在溶解氧的参与下，氧化成水和CO2。因此用脂肪作碳源时需比糖代谢供给更多的氧。9、培养基设计的一般步骤？培养基成分选择考虑的问题？1、首先必须做好调查研究2.其次，对生产菌种的培养条件3、最好先选择一种较好的化学合成培养基做基础，开始时先做一些摇瓶试验;然后进一步做小型发酵罐培养，摸索菌种对各种主要有机碳源和氮源的利用情况和产生代谢产物的能力。4、有些发酵产物，如抗生素等，除了配制培养基以外，还要通过中间补料法，一面对碳及氮的代谢予以适当的控制，一面间歇添加各种养料和前体类物质，引导发酵走向合成产物的途径。此外，还需注意培养过程中的pH变化，观察适合于菌种生长繁殖和适合于