利用果皮生产淡紫拟青霉菌剂的研究

利用果皮生产淡紫拟青霉菌剂的研究

植物线虫给农业生产造成了巨大的经济损失。根据“世界增长约占世界增长的5%”，全国农业生产每年减少约23亿株。尽管化学预防有一定的效果，但也存在许多问题。例如，高价格、对外贸易、容易造成农产品污染和污染。因此，农业控制是必然趋势。土壤中的线虫受到许多生物因素的影响，而吃虫基质是自然条件下抑制线虫的主要因素。首先，考虑到了柳绿线和绿线的关系。jatala等人在秘鲁发现了以南绿带（1979年）的卵，并成为许多植物线虫的内生菌。近年来，随着国内外的研究日益增多。一些国家的研究正在推迟。明朝太祖、刘兴忠、马成旭和潘桑东先后对这一领域进行了研究。现在，我们正在控制和实现中国制造的原料细菌，并取得了令人满意的进展。为了进行大规模生产，必须考虑到工业成本，生物杀虫剂的制备需要考虑到上述材料产生的细菌直径和细胞大小的生物学特性，并对其进行药物试验。同时，我们还进行了药物试验。试验结果如表所示。1材料和方法1.1pl4910菌株和不同浴场的水果品种本实验所用的淡紫拟青霉菌种是作者1994年从厦门番茄根部寄生的南方根结线虫卵块中分离得到的Pl9410菌株,淘米水取自厦门大学学生食堂,西瓜皮、香蕉皮、菠萝皮等从海滨浴场的水果摊上拾获.1.2不同培养基的制备1.2.1培养基ph值的确定把菠萝皮、香蕉皮、西瓜皮等各种果皮切碎,加少量水,投入高速组织捣碎机内打浆(转速12000r/min,3次,每次3min,间歇5min),用两层纱布过滤,滤液按1.5%~2.0%的比例加入琼脂,溶解后分装于试管或茄子瓶中,高压灭菌后制成斜面,菠萝皮制的培养基pH值要调到7.0左右.1.2.2小麦粉培养基的制备静置一段时间后倾去上清液,沉淀液用比重计测定为1.4Be左右,按每瓶100mL分装振荡烧瓶中,经高压灭菌后接种淡紫拟青霉的一级培养物.淘米水也可以按上述比例加琼脂制成斜面培养基.1.3平板均制备和日生长量测定把1.2.1配制好的各种固体培养基按每管20mL分装于试管,高压灭菌后按无菌操作倒入灭菌过的培养皿内制成平板,然后用首尾划线法把淡紫拟青霉接种到平板上,28℃培养7d后测量单个菌落的大小,并计算平均日生长量.平均日生长量=菌落大小/天数.继续培养7d后,再测量菌落大小和孢子大小.1.4菌落总数的测定把已经配好的PDA培养基分装,20mL/管,高压灭菌,培养皿若干包装灭菌备用.精确称取菌剂样品1g,准至0.0002g,按无菌操作法放入装有25粒5号玻璃珠的三角烧瓶中,量取无菌蒸馏水100mL加入三角烧瓶,塞上棉花塞,康氏振荡器(200次/min)振摇20min后静止片刻,即为10-2孢子悬浮液(第1次稀释);吸取上述10-2孢子悬浮液1.0mL,注入第2个带同样玻璃珠的三角烧瓶中,加入99mL灭菌蒸馏水,塞上棉花塞,同上振摇20min,即为10-4孢子悬液(第2次稀释),如此一直稀释至10-8孢子悬浮液(即为第4次稀释),或者从10-6孢子悬浮液中吸取1.0mL注入21mm×180mm的试管,加入9.0mL的无菌蒸馏水,摇匀成10-7孢子悬浮液.将加热融化并冷却至55℃左右的培养基,放在水浴锅中52℃保温待用.将上面稀释好的两种浓度孢子悬浮液,按无菌操作要求各吸取1.0mL注入灭菌过的培养皿中,每种浓度重复5个培养皿,并立即把已融化好待用的培养基按每个平板20mL分注,迅速正向和反向旋转平板3次,使菌体与培养基充分混合摊布均匀,平放静置30min.待凝固好,把培养皿倒扣过来,置28℃恒愠箱内培养3~4d.等长出淡紫拟青霉菌落时,从培养箱取出平板,马上用记号笔计数淡紫色菌落数.样品的成菌落单位CFU(个/g)按下式计算:CFU=ε×h1式中:CFU为1g菌剂所含的成菌落单位ε为同稀释度5个培养皿的菌落平均数h1为样品的稀释倍数1.5根结线卵虫种的制备直径17cm,深度17cm的小花盆5个,每盆装沃土1600mL,经湿热灭菌后分别接种用淘米水振荡培养、剩面条扩大培养的菌剂,接种剂量分别为0.1g,0.2g,0.4g和0.8g,另设一盆对照.3d后每盆各接种根结线虫卵306粒,各移入番茄苗2株,夏季室外培育50d后翻盆,洗净根系解剖虫体.2结果2.1剩下的食物和三种果皮使用寿命来吸收紫外和绿霉淡紫拟青霉在以剩饭、西瓜皮、香蕉皮和菠萝皮制成的培养基上以及PDA培养基上的生长情况见表1.2.2细菌剂的最终单位为用淘米水等食堂废料制成的4批淡紫拟青霉菌剂CFU测定结果见表2.2.3测定细菌剂的疗效接种用淘米水-剩面条培养的菌剂在室外生长50d的番茄解剖结果见表3.3讨论3.1各种果皮的生长状况及其对人才培养的影响从表1可以看出,用剩饭和西瓜皮、菠萝皮、香蕉皮等多种果皮制成的培养基,淡紫拟青霉都能在其上生长,但菌落的生长情况有所不同.剩饭培养基培养的淡紫拟青霉,其生物学特性,包括孢子大小、平均日生长量和菌落大小,都明显地比PDA上培养的要好.西瓜皮上的平均日生长量和菌落大小,明显地比PDA上培养的大,只是孢子质量不如PDA上培养的好;而香蕉皮和菠萝皮上培养的则明显比PDA上培养的差.此两种果皮相比较,菠萝皮上培养的平均日生长量要好一些,而香蕉皮上培养的孢子稍大一些.上述试验结果表明,用食堂下泔和各种果皮做原料生产淡紫拟青霉菌剂具有巨大潜力.福建地处亚热带,水果资源十分丰富.根据统计资料,1994年厦门市水果总产量28.06万t(不含西瓜),其中菠萝538t,香蕉9563t.此外,西瓜3012t.1994年福建省水果总产量153.75万t(不含西瓜),其中菠萝26501t,香蕉301290t.此外,西瓜381657t.纵然按10kg果产生1kg果皮,10kg果皮制造1kg菌剂计算,纵然只有一半的果皮得到利用,哪怕是1/4,都是一笔很可观的数字.本文仅仅是废弃物利用方面的一个初步探讨,虽然各种果皮培养的效果各不一样,但可以预料:(1)如果把几种废料混合,可能提高培养效果,因为每一种废料所含的营养成份不一样,有的成份有利于菌丝生长(碳源),有的有利于孢子生长(氮源).培养基设计的技巧在于合理地掌握碳氮比.由于时间限制,本文没有就此继续探讨,这方面的工作今后还要进行.(2)本项研究旨在利用食堂废弃物,严格限定为不得添加其他原料(农副产品及微量元素等),若添加其它原料,当可进一步提高培养效果,今后还要继续试验.3.2筛选用于干燥用淘米水等食堂废料制成的4批淡紫拟青霉菌剂,每克样品的CFU都达到109,完全达到作为真菌菌剂所要求的CFU,甚至超过.马承铸和作者制造的菌剂,CFU都在106~107,前者是用玉米粉和麦皮,后者是用啤酒渣等废料制成.而本试验是以淘米水做振荡培养,接着的固体发酵无论是用三合土(玉米粉∶麦皮∶干土=1∶1∶1),还是剩面条,每克菌剂的活孢子数都达到109,CFU是目前国内生产的菌剂的10~100倍.这说明淘米水是一种优良的培养料,完全可以用来取代常规的玉米粉和麦皮.淘米水养分丰富,可就近取材作为振荡培养的物料,只须量取,不必称重,使用方便.据调查,仅厦门大学一所学校公共食堂每天用米就达3000kg左右,即使按10∶1的比例计算(即10kg米淘出1kg水),每天可产生300kg淘米水;按实验室摇瓶法生产计算,可装3000个烧瓶振荡培养(每瓶100mL),约可生产600kg淡紫拟青霉菌剂.厦门市总人口117万,若可收取半数人口的淘米水,每天约有30000kg淘米水,可生产130t淡紫拟青霉菌剂.现在这些淘米水不加以利用,任其顺下水道流入港湾,使海水富营养化,时下已经出现的赤潮等问题可能与此不无关系.所以,利用淘米水生产淡紫青霉等生物杀线虫剂,不但能为农业解决普遍存在的线虫病害问题,也会给治理环境污染带来好处.3.3最佳施0.8g与不用药对比试验结果根据表3,从药效实验结果可以看出,在0.1~0.8g的范围内,用淘米水、剩面条制造的菌剂,随着施用剂量的增加,虫口密度有较大辐度的减少,每1600mL土壤施0.8g效果最佳,施0.8g与不施药对比,根瘤形成程度减少4级,虫瘿减少98.0%,卵块减少92.3%,雌虫减少97.7%.施0.