高级生物化学-蛋白质

第五节蛋白质的理化性质与分离纯化一、蛋白质的变性与复性蛋白质在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。

1.蛋白质变性的概念2.变性的本质次级键（有时包括二硫键）被破坏，天然构象解体。变性不涉及一级结构的破坏Denaturation3、变性理论

1931年，我国生物化学前辈吴宪提出了“蛋白质变性后，其肽链由原来紧密有序的构象变成了松散无序的构象”。这就是变性作用，并且认为天然蛋白质的紧密构造及晶体结构是由分子中的次级键互相联系而形成的，所以容易被物理的和化学因素所破坏，这个观点反映了蛋白质变性本质。4.变性的因素①物理因素：高温、高压、紫外线、电离辐射、超声波②化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐等。（如十二烷基硫酸钠即SDS、尿素、盐酸胍）变性理论和变性的因素变性的因素作用机理清洁剂丙醇丙酮凝结使纠缠常用的变性剂：尿素尿素：与多肽主链竞争氢键；增加非极性侧链在水中的溶解度，从而降低疏水相互作用。尿素或者胍变性剂：十二烷基硫酸钠（SDS）5、变性蛋白质的特性生物活性丧失或者降低，如：Hb变性不能输送O2,酶变性失去催化作用。物性理质改变，如：溶解度降低，粘度升高，失去结晶能力，旋光值改变。(分子量不变）光吸收？化学性质改变，如：蛋白质变性时，有些原来在分子内部包藏而不易与化学试剂起反应的侧链活性基团，由于结构的伸展松散而暴露，易与化学试剂反应。生物化学性质改变：蛋白质变性后，分子结构伸展松散，易为蛋白质水解酶所分解。变性具有协同性，部分变性是可逆的化学键改变：非共价键破坏（构象改变）肽键不变（构型不变分子量不变）二硫键？有底物存在会抑制变性？二硫键多蛋白质难变性胶原蛋白有特殊共价键纯化一个耐热稳定的酶是否需要低温处理？酶敏感性的概念？蛋白质变性6、应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。此外,防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。误服重金属解毒方式?长期从事重金属作业的人吃高含蛋白质类食物？

思考核酸的变性(一)、DNA的变性(denaturation)1

定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。2

方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素、酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等3变性后其它理化性质变化：OD260增高 粘度下降比旋度下降 浮力密度升高酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失DNA的变性是爆发式的增色效应

增色效应：DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。

DNA分子中碱基间电子的相互作用是紫外吸收的结构基础，但双螺旋结构有序堆积的碱基又“束缚”了这种作用。变性DNA的双链解开，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故产生增色效应。不同来源DNA的变化不一，如大肠杆菌DNA经热变性后，其260nm的光密度值可增加40%以上，其它不同来源的DNA溶液的增值范围多在20~30%之间。

假定一个DNA大分子最初全部是双螺旋结构，在热变性后A260nm上升30%以上DNA和蛋白质变性的比较

DNA降解：指多聚核苷酸中的磷酸二酯键断裂，使分子量下降，其过程不可逆。DNA变性：空间结构遭到破坏，一级结构完好共价键完好，一般是可逆的。

4、DNA的熔解温度（Tm）：TmDNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。

DNA的熔解温度（Tm）：（1）定义：DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度。

变性剂如甲酰胺、尿素、甲醛等破坏氢键，妨碍碱基堆积，使Tm下降。DNA的Tm一般在82—95℃之间（2）影响DNA熔解温度Tm值的因素:

①

DNA均一性：

②G-C含量：G-C含量与Tm值成正比。③介质中离子强度：1、概念:若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation)

这种变性也称为可逆变性。2、方法：透析或超滤除去变性剂，或稀释3、举例：有些蛋白质的变性作用是可逆的，其变性如不超过一定限度，经适当处理后，可重新变为天然蛋白质。

7、蛋白质的复性牛胰核糖核酸酶变性和复性1DNA复性(renaturation)的定义

在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。

热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing)。2DNA复性后的理化性质变化减色效应:DNA复性时，其溶液OD260降低DNA的复性粘度上升浮力密度降低生物活性部分恢复热变性DNA在缓慢冷却时可以复性，快速冷却不能复性。

①序列简单的分子复性快，如poly(dT)和poly(dA)识别快②DNA片段愈大，扩散速度愈低，复性慢③离子强度↑→有利于复性④DNA浓度↑→复性↑复性速度与DNA的浓度成正比

⑤

环状DNA易复性一般认为比Tm低25℃左右的温度是复性的最佳条件，越远离此温度，复性速度就越慢影响复性的因素复性速度可用Co·t衡量Cot1/2值：（1）概念：当C/CO＝１/2时的Cot值定义为Cot1/2值，

Cot1/2＝１/ｋ，即复性一半时的Cot值.（2）影响Cot1/2值的因素：不同的DNA的Cot1/2值是不同的与ｋ值有关；而且DNA分子序列的复杂性影响ｋ值．DNA分子序列的复杂性（Ｘ值）：

(1)定义为：最长的没有重复序列的核苷酸对的数值．

如（ATATAT）,其Ｘ值为２,（ATGC）（ATGC）ｎ的Ｘ值为４．(2)Ｘ值与Cot1/2值的关系，Ｘ=ｋ·Cot1/2

Cot1/2是与基因组的大小成正比的Cot1/2

表明基因组所包含不同序列的总长度复性的Cot1/2

与其复杂度成正比。任何DNA

的复杂度可以通过与复杂度已知的DNACot1/2

比较得出。通常以大肠杆菌DNA作为标准。假设4.2×106

bp

大肠杆菌基因组由不同序列组成（1）阳离子可以中和DNA中所带负电荷的磷酸基团，减弱DNA链间的静电作用，促进两条互补的多核苷酸的相互靠近，从而促进DNA的复性。（2）温度升高可使DNA变性，因此温度降低到熔点以下可以促进DNA的复性。（3）DNA链的浓度增加可以加快互补链随机碰撞的速度，从而促进DNA的复性。试述下列因素如何影响DNA的复性过程。(1)阳离子的存在(2)低于Tm的温度(3)高浓度的DNA链思考

在复性反应中如何知道单链已经结合成双链了呢可以通过哪些法来检测？

(1)减色效应(hpochromiceffcef)

测定光密度,即OD值(opticaldensity),DNA从单链变成双链，OD260减少30%

(2)羟基磷灰石柱层析

羟基磷灰石对双链DNA吸附较牢,不易吸附单链

思考蛋白质变性后，其性质有哪些变化？（9分）

厦门大学2005年生物化学考研试题厦2.蛋白质变性主要由于氢键的破坏这一概念是由Anfinsen提出来的（是非题-）复旦大学2000年3.蛋白质变性的实质是非共价键断裂，天然构象解体，但共价键未发生断裂。（是非题-）中国科学院06年4.1所有变性蛋白质都可以复性。（是非题-）4.2核酸变性后对紫外光的吸收能力增强。（是非题+）4.3核酸热变性有何特点？Tm值和Cot值分别表示什么？各有何应用价值？华东师范大学2006年思考题江苏大学2004年硕士研究生入学考试生物化学试卷5.1核酸变性或降解时，出现减色效应。（是非题-）5.2结晶蛋白质都是变性蛋白质。（是非题-）5.3盐析法可使蛋白质沉淀，但不引起变性，所以常用于蛋白质的分离和纯化。（是非题+）5.4蛋白质的变性是蛋白质分子立体结构的破坏，因此常涉及肽键的断裂。（是非题-）5.5变性DNA的复性与

、

、

、

、

等有关。思考题6．下列关于蛋白质变性的叙述，哪项是错误的?

A．生物活性降低或丧失

B．蛋白质空间构象破坏

C．280nm光吸收反应增强

D．溶解度增加

E．易被蛋白酶水解江苏大学医学院2005年医学生物化学（硕士）7.双链DNA分子中GC含量越高，Tm值就越大（）

复旦大学2000年8.DNA的Tm值

A.只与DNA链的长短有直接关系

B.与GC碱基对的含量成正比

C.与AT碱基对的含量成正比D.与碱基组成无关

E.所有真核生物Tm都一样湛江海洋大学2003年

思考题（一）蛋白质的两性电离

蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。

在蛋白质分子中，游离的α—NH2和α—COOH相距较远，静电引力减弱，故：

a末端的α—NH2的pK′值减少

b末端的α—COOH的pK′值增大二、蛋白质的理化性质蛋白质的等电点(isoelectricpoint,pI)

当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。在等电点时蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。蛋白质酸性氨基酸残基数碱性氨基酸残基数碱性氨基酸酸性氨基酸比值等电点胃蛋白酶3760.21.0血清清蛋白82991.24.7血红蛋白53881.76.7核糖核酸酶7202.99.5

pH=pI时，蛋白质净电荷为零，蛋白质分子在电场中不移动

pH＞pI时，蛋白质净电荷为负，蛋白质分子在电场中向阳极移动

pH＜pI时，蛋白质净电荷为正，蛋白质分子在电场中向阴极移动在pI时，蛋白质失去了胶体的稳定条件，即没有相同电荷相互排斥的作用。所以不稳定，溶解度最小，易沉淀。溶液中蛋白质颗粒思考题1．处于等电点的蛋白质（）

a.分子不带电荷b.分子最不稳定,易变性c.分子带的电荷最多d.易聚合成多聚体e.易被蛋白酶水解

2．将蛋白质溶液的PH值调节到其等电点时（）

a.可使蛋白质稳定性增加

b.可使蛋白质表面的净电荷不变

c.可使蛋白质表面的净电荷增加

d.可使蛋白质胶体溶液稳定性降低，易于沉淀。

e.对蛋白质表面水化膜无影响思考题

中国科学院2002年研究生入学试题（判断）3.1酶的最适pH与酶的等电点是两个不同的概念,但两者之间有相关性,两个数值通常比较接近或相同.3.2蛋白质的等电点和它所含的酸性氨基酸残基和碱性氨基酸残基的数目比例有关3.3蛋白质在处于等电点时的溶解度A.最小;B.最大;C.与等电点没有关系.4.1．溶液的pH可以影响氨基酸的等电点（判断）.

南京大学20005、在某一溶液中含有三种蛋白质，其性质如下

a

相对分子质量40000

等电点8.5b

400005.9c

600005.9设计一个方案纯化这三种蛋白。苏州大学2005思考题2、蛋白质的等离子点（特征常数）蛋白质的等电点在有中性盐存在下可以发生明显的变化，原因是蛋白质分子中某些解离基团与中性盐中的离子相结合。蛋白质的等电点在一定程度上决定于介质中离子的组成。

等离子点（isoionicpoint）：没有其它盐类干扰时，蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称为等离子点(蛋白质的等离子点：指在纯水中（即没有其它盐类存在）蛋白质的正离子数等于负离子数的pH值。)（二）、蛋白质的胶体性质1.蛋白质溶液稳定的因素：

蛋白质分子大小属于胶体质点范围（1）水化层：分子表面上亲水基团在水溶液中能与水分子起水化作用（2）双电层（电荷）：分子表面上的可解离基团，在适当的pH条件下，都带有相同的电荷，与其周围的反离子构成稳定的双电层。2、蛋白质的沉淀（1）概念：蛋白质分子发生凝聚，从溶液中析出的现象。（2）原理：破坏稳定因素：水化膜和双电层

（3）沉淀方法：①盐析法②有机溶剂沉淀③重金属盐沉淀条件:pH＞pI(Pr-M+)

④某些酸类沉淀条件：pH＜pI(Pr+X-)

⑤抗体对抗原蛋白质的沉淀⑥等点的沉淀①盐析法定义：加高浓度中性盐使蛋白质沉淀析出的现象。

常用的中性盐主要有硫酸铵，优点是温度系数小而溶解度大（另外：NaCl、NaSO4等）。原理：破坏蛋白质胶体周围的水化膜，中和了蛋白质分子的电荷，使蛋白质沉淀而析出。分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。蛋白质不变性温度;pH值;蛋白质浓度影响盐析的因素有：盐析法-实例分析血清中加硫酸铵至50%饱和度，则球蛋白先析出；继续加入硫酸铵至饱和，则清蛋白沉淀析出。微生物发酵生产酶制剂就是采用盐析的作用原理，从发酵中把目的酶分离提取。②有机溶剂沉淀

有机溶剂（和水互溶）乙醇、丙酮等。

原理：有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因是（1）加入有机溶剂使水溶液的介电常数降低，因而增加了两个相反电荷基团之间的吸引力，促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。（2）有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一种解释认为与盐析相似，有机溶剂与蛋白质争夺水化水，致使蛋白质脱除水化膜，而易于聚集形成沉淀。低温蛋白质不变性有机溶剂沉淀蛋白质时，介电常数的增加使离子间的静电作用的减弱而致（判断）复旦大学2002年有机溶剂沉淀

pH=pI时，可加速蛋白质沉淀。

低温（0℃∽4℃）。低温蛋白质不变性有机溶剂沉淀注意事项有机溶剂长时间作用于蛋白质会引起变性，操作时需注意：（1）低温操作：提取液和有机溶剂都需事先冷却。向提取液中加入有机溶剂时，要边加边搅拌，防止局部过热，引起变性。（2）有机溶剂与蛋白质接触时间不能过长，在沉淀完全的前提下，时间越短越好，要及时分离沉淀，除去有机溶剂。实例分析：食品级的酶制剂的生产，中草药注射液、胰岛素的制备大都用有机溶剂分离沉淀蛋白质。有机溶剂的添加量最好不超过沉淀目的酶所必要的数量，多加有机溶剂会使更多的色素、糊精及其它杂质沉淀。③重金属盐沉淀

氯化高汞、硝酸银、醋酸铅、三氯化铁等。蛋白质变性反应条件:pH<pI

NH3+PrCOO-

NH3+PrCOOHH+X-

NH3+X-PrCOOH不溶性蛋白盐苦味酸、单宁酸、钨酸、鞣酸、三氯乙酸等。X-：酸根蛋白质变性机理：在酸性条件下，蛋白质带正电，可以与生物碱试剂的酸根离子结合而产生沉淀。④生物碱试剂和某些酸类沉淀生物碱试剂和某些酸类沉淀实例分析

实例分析：在啤酒生产工艺中有麦芽汁加啤酒花煮沸的工序，其目的之一就是借酒花中的单宁类物质怀变性蛋白质或盐形成沉淀，使麦芽汁得以澄清，从而防止成品啤酒产生蛋白质混浊。“柿石症”的产生就是由于空腹吃了大量的柿子，柿子中含有大量的单宁酸，使肠胃中的蛋白质凝固变性而成为不能被消化的“柿石”⑤等电点沉淀：蛋白质不变性，原理？⑥加热变性沉淀实例分析：我国很早便创造了将大豆蛋白质的浓溶液加热并点入少量盐卤（含MgCl2）的制豆腐方法，这是成功地应用加热变性沉淀蛋白的一个例子。蛋白质溶液出现沉淀与蛋白质变性存在必然的关系。

中国科学院05年判断题蛋白质沉淀剂都能引起蛋白质明显的变性

2003年福州大学研究生入学试题

蛋白质沉淀未必变性，变性未必沉淀A.可逆沉淀

在发生沉淀反应时，分子内部、空间结构并未发生显著变化，基本上保持原有的性质，沉淀因素除去后，能再溶于水溶液中。这种作用称为可逆沉淀反应。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质以及利用等电点的沉淀，提纯蛋白质时，常利用此类反应。B.不可逆沉淀/变性沉淀在发生沉淀反应时，内部结构、空间构象遭到破坏，失去原来的天然性质，这时蛋白质已发生变性。这种变性蛋白质的沉淀不能再溶解于原来溶剂或水溶液中的作用称为不可逆沉淀反应或变性沉淀。重金属盐、生物碱试剂，强酸、强碱、加热、震荡、超声波、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。沉淀类型沉淀DNA1、预冷无水乙醇沉淀DNA（

0.6倍体积的异丙醇）

DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合。2.在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl

？

在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。在用乙醇沉淀DNA时可使B-DNA向A-DNA转化？沉淀DNA1.酒精沉淀核酸时，下列何种长度核苷酸不能被沉淀（）

10；

20；

50；

100

中国科学院2003年

2.与氨基酸相似的蛋白质性质是:

A,高分子性质B,胶体性质C,沉淀性质D,两性性质E,变性性质

青岛大学2009年

（三）蛋白质的紫外吸收大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸的在280nm附近有最大光吸收。因此，大多数蛋白质在280nm

附近显示强的吸收。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定利用这个性质，可以对蛋白质进行定性定量鉴定。比色管三、蛋白质的分子大小和形状蛋白质是分子量很大的生物分子，相对分子质量大于6000，最高可达40000000（烟草花叶病毒）。测分子量的方法：★化学组成测定最低分子量★SDS法★凝胶过滤法★渗透压法★扩散系数法★沉降系数法和沉降平衡法

利用化学分析定量测定蛋白质中某一特殊元素的含量，并假定蛋白质分子中含1个这种元素，即可测算最低Mr。

如：用化学分析法测定血红蛋白质中含Fe0.34％，则最低Mr=55.84×100/0.34=16700；

用其它方法测定，其实际Mr为16700的4倍，由此可知，血红蛋白含有4个Fe的原子，而不是1个Fe。

牛血清白蛋白含Trp0.58%

最低M=35200，实际为69000，含2个Trp

1、根据化学成分测定最小相对分子质量例题：一种纯酶含亮氨酸（Mr131）1.65%，含异亮氨酸

（Mr131）2.48%，求最低相对分子质量。解：按照Leu的百分含量计算，最低MrX1：

X1=(100

131)/1.65=7939.4按照Ile的百分含量计算最低MrX2：

X2=(100

131)/2.48=5282.3由于X1和X2数字差异较大，提示这种酶含Leu和Ile不止1

个，为了估算Leu和Ile的个数，首先计算：

X1/X2=7939.4/5282.3≈1.5

这种酶含任何氨基酸的个数均应是整数，说明该酶至少含有2个Leu，3个Ile，其最低相对分子质量为：

7939.4

2=15878.8或5282.3×3=15846.9根据化学成分测定最小相对分子质量2、根据渗透压测定平均分子量渗透压摩尔数等电点附近称重3、扩散系数法测定平均分子量扩散：由于浓度差引起的溶质分子的净迁移。扩散的热力学驱动力是熵的增加。扩散系数D：等于当浓度梯度为一个单位时，在一秒钟内通过1cm2面积所扩散的溶质量。扩散系数随Mr的增加而降低，但对Mr的变化不敏感。对球形的大分子来说，扩散系数与Mr的立方根成反比。扩散系数法测定平均分子量4.沉降分析法分为沉降速度法和沉降平衡法两种，也可以用于蛋白质或DNA的分离

（A）沉降速度法：在60000～80000r/min

的高速离心力作用下，蛋白质分子会沿旋转中心向外周方向移动。用光学方法测定界面移动的速度即为蛋白质的离心沉降速度。蛋白质的沉降速度与分子大小和形状有关，因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。超速离心法既可以用来测定蛋白质的分子量也可以用作分离纯化蛋白质。沉降分析法-沉降速度法沉降系数：溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度，用S表示。一个S单位，为1×10-13秒。相对分子质量越大，S值越大。蛋白质的沉降系数：1～200S。

s=————vω2x

沉降系数：质量1克的物质在离心场中受到1dyn的离心力作用下，1秒钟下降的距离。沉降分析法-（B）.沉降平衡法

在离心过程中，外围高浓度区的蛋白质向中心扩散，如转速较低，二者可达到稳定平衡。此时测定离心管中不同区域的蛋白浓度，可按下式计算分子量：其中C2和C1是离轴心距离为x2和x1时的蛋白质浓度。沉降平衡法的优点是不需要扩散系数，且离心速度较低（8000－20000转每分）。但要达到平衡常常需要几天时间。M=2RTln(C2/C1)÷[ω2(1－Vρ)(x22－x12)]比较：核酸的沉降特性（1）密度梯度超速离心测定核酸的浮力密度：

8MCsCl，45000rpm，16h

密度梯度：1.80g/ml→1.55g/ml

平衡时：浮力密度=CsCl密度=离心力ρ=ρ0+4.2ω2（r2-r02）×10-10（2）密度梯度超速离心测定DNA的G-C含量

G-C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系ρ=0.1xG-C+1.658xG-C=（ρ-1.658）×10

但是5-甲基胞嘧啶多的DNA，其实际浮力密度会降低，低于理论值？。核酸的沉降特性与超速离心的应用（3）密度梯度超速离心研究核酸的构象（4）密度梯度超速离心纯化

RNA或不同构象的DNA超螺旋DNA或RNA＞DNA变性DNA＞双链DNA＞蛋白质，变性程度越大，浮力密度越大密度5、凝胶过滤法

原理：凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构。一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外。洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大。也可以用于蛋白质分离纯化。

洗脱体积：自加入样品开始到该组分的洗脱峰峰顶（即收集液中该组分浓度最大时）出现时所流出的洗脱液体积。凝胶过滤法凝胶过滤法测定样品蛋白质分子量的方法：①测得几种标准蛋白质的洗脱体积〔Ve〕；②以相对分子质量对数（logM）对Ve作图,得标准曲线；③再测出未知样品洗脱体积〔Ve〕；④从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量。6.SDS电泳来测定蛋白质的分子量SDS电泳来测定蛋白质的分子量SDS电泳

SDS电泳电泳时，它的迁移率一般电泳时它的迁移率SDS电泳来测定蛋白质的分子量的方法①用SDS和巯基乙醇（打开二硫键）处理蛋白质变性并与SDS结合，形成SDS-蛋白质复合物，使得不同蛋白质分子均带负电（SDS带负电），且荷质比相同；不同蛋白质分子具有相似的构象。②用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的迁移率作图③测出待测样品的迁移率④从标准曲线上查出样品的相对分子质量SDS电泳来测定蛋白质的分子量的方法绘制标准曲线：以标准蛋白质分子量的对数log(M)为纵坐标，Rf值为横坐标，绘制标准曲线。Disc(native)(自然性电泳法)NoncovalentcovalentHowaboutcovalentlink?或巯基乙醇★此方法只能测得亚基肽链的相对分子质量SDS：十二烷基磺酸钠

1、溶解膜蛋白及脂肪，从而使细胞膜破裂2、溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来，使蛋白质与核酸分离3、使蛋白质变性沉淀4、对核酸酶有抑制作用5、屏蔽蛋白质电荷：SDS6、改变蛋白质形状：SDS

SDS：十二烷基磺酸钠

1．下列哪种方法可用于测定蛋白质分子量（）

a.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳b.凯氏定氮法

c.280/260nm紫外吸收比值d.荧光分光光度法

e.茚三酮反应

2．蛋白质变性是由于（）

a.蛋白质一级结构改变b.蛋白质亚基解聚

c.蛋白质空间构象破坏d.辅基脱落

e.蛋白质水解四、蛋白质分离纯化的一般原则盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀层析和电泳保存方法：①晶体保存：结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否结晶不仅是纯度的一个指标，也是判断制品是否有活性的指标。纯度越高，溶液越浓，越容易结晶。结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、盐析、加有机溶剂、调节pH、接入晶种。②冻干粉保存：③溶液保存：加入抗冻剂（50%甘油）后-20--70℃保存。★根据分子大小分离★根据蛋白质的溶解度分离★根据电荷差异分离★根据配体特性异性分离（亲和层析）★选择性吸附分离（物理吸附）★根据疏水性的差异

主要方法Proteinpurification五、分离纯化蛋白质（一）、根据分子大小和形状的差异：①透析和超滤法：除去小分子物质②密度梯度离心法③凝胶过滤法方法

1、透析和超过滤

透析：根据的是蛋白质不能通过半透膜的性质，而水和无机盐等小分子自由通过，此方法只能将蛋白质和小分子物质分开，不能将不同蛋白质分开。超过滤超过滤：是利用外加压或离心使水和其他分通过半透膜，蛋白质留在膜上。

浓缩：使用超滤来增加所需大分子溶质的浓度，即大分子被超滤膜截留而小分子和溶剂可自由通过。梯度分离：按分子大小梯度分离样品中的溶质分子时，超滤是一种经济有效的方法。脱盐／纯化：脱盐即从大分子溶液中去除盐、非水性溶剂和小分子物质的过程。超滤的主要应用：透析和超过滤1、辅酶或辅基的判断2、可逆抑制剂和不可逆抑制剂判断3、蛋白质浓缩除盐或小分子化合物4、牛胰核糖核酸酶本性和复性试验2.密度梯度（区带）离心密度梯度（区带）离心3、凝胶过滤又称分子筛层析，是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。常用葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex)和琼脂糖凝胶（商品名Sepharose）。网孔大小—用交联剂与葡聚糖或琼脂糖的比例实现。大分子先洗脱下来，小分子后洗下来。（保持天然酶状态）

凝胶过滤可用于：蛋白质分离纯化、分子量鉴定、或浓缩除盐葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex)交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200克每克千胶吸水20克。因此，“G”反映，凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。后面的阿拉伯数字越大,表示交联越小,凝胶孔径越大,分子量分离范围越大.凝胶的溶胀体积.

当我们从生物组织中用盐析法提取蛋白质后，常需要进行蛋白质的脱盐工作，可介质为葡聚糖凝胶G-25用适当的洗脱剂进行洗脱，经凝胶层析，就可以将大分子蛋白质与小分子盐类分离。蛋白质和盐哪个先洗脱？凝胶过滤凝胶过滤1．今有下列蛋白质的混合物：

A.分子量12000pI=10B.分子量62000pI=4

C.分子量28000pI=7D.分子量9000pI=5

若不考虑其它因素，当它们：

（1）流经阴离子交换剂DEAE纤维素，用线性盐梯度洗脱时（2）流经SephadexG-50凝胶排阻柱时；这些蛋白质的洗脱顺序如何？2．下列方法中哪一种不能将谷氨酸和赖氨酸分开？（）

a.纸层析b.阴离子交换层析c.阳离子交换层析

d.凝胶过滤e.电泳（二）利用溶解度差别的分离方法：盐析法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法重金属盐选择性沉淀法（pH》pI，蛋白质带负电荷）生物碱和酸选择性沉淀法（pH《pI，蛋白质带正电荷）热处理沉淀法（铜锌SOD，65℃、15分钟、稳定

1.等电点沉淀和PH控制2、有机溶剂分级分离法（1）定义：利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不同而使蛋白质分离的方法，称为有机溶剂沉淀法。经常使用的有机溶剂是乙醇和丙酮。（2）作用机理：

（1）降低水溶液的介电常数，使溶质溶解度降低；（2）破坏大分子周围水膜，使溶解度降低。（3）优点：比盐析法析出的沉淀容易过滤或离心分离，分辨力比盐析法好，溶剂也容易除去。3、盐溶和盐析常用的盐：为溶解度大的中性盐，如(NH4)2SO4、NaCl、MgCl2、NH4Cl、KCl等的饱和溶液盐溶：低浓度的中性盐在蛋白质分子表面形成双电层使蛋白质溶解度增加；盐析：高浓度的中性盐破坏蛋白质分子表面的水化层使蛋白质溶解度降低，发生沉淀析出。（PH多在PI）分段盐析：不同蛋白质盐析所需的盐浓度不同，蛋白质溶液中，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，称分段盐析（例如：半饱和硫酸铵溶液可沉淀可卵清球蛋白，而饱和硫酸铵溶液沉淀卵清清蛋白）盐溶盐析有A,B,C

三种蛋白质,在PH=7进行电泳，结果如下图。若在PH=7用中性盐沉淀这三种蛋白质，哪种首先沉淀，其次是哪一种，最后是哪一种？

从电泳结果可知PH7

时C蛋白带电最多，B蛋白次之，A最少，在PH7时用中性盐沉淀，带电最少的首先沉淀。因此

A先沉淀，其次是B，最后是C。思考题（三）根据电荷不同的分离方法

电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。分子大小不同的蛋白质所带净电荷密度不同，迁移率不同，电泳时可以分开自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。电泳和离子交换层析自由界面电泳区带电泳支持介质种类的不同，区带电泳可分为：①纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。②醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。支持介质种类的不同，区带电泳可分为：③淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一层剥层分析（一板多测）。天然淀粉经加工处理即可使用，但孔径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大，很难得到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率低，实验室中已很少使用。④琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。⑤聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS原理：该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。。

聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类。

连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷不同和分子筛效应进行分离。

不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均比前者更佳。不连续系统聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩效应：聚丙烯酰胺凝胶电泳示意图

1.某蛋白质溶液分别用SDS和阳离子交换柱层析进行分析，得到如图所示的结果。关于该溶液中蛋白质的组成，你的结论是什么？思考题阳离子交换柱层析进行分析SDS2.比较说明SDS(SDS-聚丙烯酰胺电泳)和琼脂糖凝胶电泳的物质浙江大学20042、等电聚焦电泳：在电泳支持介质中加入载体两性电解质通以直流电后在正负极之间形成稳定、连续和线性的pH梯度，蛋白质在pH梯度凝胶中受电场力作用下泳动，它的分离仅仅决定于其本身的等电点。当蛋白质分子一旦到达它的等电点位置，分子所带净电荷为0，就不能再迁移。如果它向等电点两侧扩散，净电荷就不再为0，都会被阴极或阳极吸引回来，直至回到净电荷为0的位置，因此蛋白质在与其本身pI相等的pH位置被聚焦成窄而稳定的区带。这种效应称之为“聚焦效应”。保证了蛋白质分离的高分辨率，是等电聚焦最为突出的优点。等电聚焦电泳：2Delectrophoresis1stdimensionSeparationbasedonpIisoelectricfocusing2nddimensionNormalSDS3、离子交换层析法离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。离子交换层析法离子交换基质阳离子交换剂适合分离PI>7的蛋白质(先用pH值低于7的缓冲液处理)阴离子交换剂适合分离PI<7的蛋白质(先用pH值高于7的缓冲液处理)(2)洗脱方法在离子交换层析过程中，常用梯度溶液进行洗脱，而溶液的梯度则是由盐浓度或酸碱度的变化形成的。一种是增加离子强度的梯度溶液。二、改变pH值的梯度溶液，如果使用的是阳离子交换剂，pH值应从低到高递增；如果使用的是阴离子交换剂，pH值应从高到低递减。1.某些蛋白质的等电点（pI）为5.0，在pH6.0的条件下能否采用CM-纤维柱层析(阳离子)来纯化该蛋白质,试说明理由。

厦门大学2004年生物化学考研真题2.SDS测定蛋白质分子量的方法是根据蛋白质分子所带电荷不同（判断）。苏州大学2004

3.SDS是根据蛋白质分子极性大小来对它们进行分离的一种电泳技术（判断）.

中国科学院微生物研究所

4.12.下列有关核酸电泳和SDS电泳说法错误的是

A.核酸电泳和SDS电泳中DNA和蛋白均向正极泳动；B.SDS不连续垂直电泳中，上层是分离胶，下层是浓缩胶；C.RNA分离需要变性条件下的琼脂糖凝胶电泳；D.核酸电泳中溴化乙啶结合DNA的碱基对，在紫外下显色

中国计量学院2008年

思考题

1、极性的硅胶和氧气铝以及非极性的活性碳等具有吸附能力

2、吸咐层析法是：利用物质与不同蛋白质的吸附能力的强弱不同达到分离目的。

3、蛋白质提纯中，最广泛和最有效的是结晶磷酸钙即羟基磷灰石。（四）蛋白质的选择吸附分离羟基磷灰石疏水作用层析疏水层析利用高盐吸附、低盐洗脱的原理

根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质之间的疏水性作用力强弱不同，疏水作用层析就是依据这一原理分离纯化蛋白质和多肽等生物大分子的。

1.是一种极为有效的分离方法

2.根据蛋白质分子能与另一种称为配体的分子特异而非共价地结合。

3.将某一蛋白质的配体经适当的反应共价地连接到如琼脂糖（凝胶）一类的载体表面。

4.配体指能被生物大分子所识别并与之结合的原子、原子团和分子，如：酶的作用底物、辅酶、调节效应物及其结构类似物，激素和受体蛋白、抗原和抗体互为配基。

5.用含有自由配体的溶液洗脱蛋白质Affinitychromatography（五）根据配体特异性的分离—亲和层析Affinitychromatography/products/protein/images/fig_LC_flexible_immobilization.gifGSTtag从总RNA分离纯化mRNA-亲合层析法已知蛋白质X是一种真核生物蛋白质。某实验室利用大肠杆菌对该蛋白质进行了表达，以获得一定量的高纯度的蛋白质进行研究。蛋白质X特性如下：

①相对分子质量为49500；

②等电点为4.2；

③具有磷酸水解酶活性，最适pH=8.0；

④在大肠杆菌中表达时容易形成包涵体。

请为该蛋白质设计一套最有效的纯化方案。要求：

①纯化方案开始于收集菌体，终止于蛋白质X的鉴定，实验分步进行；②充分利用已知条件；③解释每一步操作的理由；北京师范大学2006年思考题包涵体包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。分析：（1）.用缓冲液漂洗菌体细胞，离心收集菌体（2）.破碎细胞，离心收集包涵体（3）.破碎包涵体释放蛋白质（4）.根据等电点和分子量设计分离方式（5）.根据活性鉴定分离得到的酶思考题1.怎样从组织中分离提纯某一特定蛋白质？（简述主要步骤和使用的方法）（20分）华南理工大学2006年

2.1在一抽提液中含有三种蛋白质,其性质如下:蛋白质

相对分子质量

等电点A

20000

8.5B

21000

5.9C

5000

6.0试设计一个方案来分离纯化这三种蛋白质。2.2若细胞色素C，ß-乳球蛋白，一种未知蛋白质和血红蛋白用凝胶过滤分离时，其洗脱体分别为118、58、37与24ml，试问未知蛋白质的相对分子质量。(假定所有蛋白质都是球形的,相对分子质量都是在凝胶过滤的分级分离范围内。)

华东师范大学2007年生物化学

亲和层析是分离纯化生物活性物质较常采用的方法之一，已成功地应用在人绒毛膜促性腺激素等药物的分离，由于其条件较容易控制，通过该方法或得的生物活性物质活性很少丧失。其原理是将具有识别能力的配体以共价键的形式固化到含有活性基团的基质上，制成亲和吸附剂，也称固相载体。而固化后的配体仍然保持束缚特异物质的能力，因此把固相载体装入层析柱，当欲分离的样品通过该柱时，样品中对配体有亲和力的物质就可以借助静电引力，范德瓦尔力，以及结构互补等效应被吸附到固相载体上，而无亲和力的非特异性物质则被起始缓冲也洗脱出来。尔后通过该便起始缓冲也的pH值，或增加离子强度即可将特异性结合在配体上的物质洗脱下来，从而达到获取特定生物活性物质的目的。

在此基础上，我们可以寻找、发掘适合各种有药物作用的生物活性物质的配体，从复杂的基质中分离纯化诸如褪黑素、干扰素等一系列的药物，并保证所获得的物质具有较高的生物活性思考题武汉科技大学2005年核酸的分离纯化1细胞的破碎液氮研磨法化学处理法(SDS等）生化法（溶菌酶、纤维素酶等）2核蛋白的解聚、变性蛋白的去除

2.1加入浓盐溶液（如NaCl）核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚

2.2加入SDSSDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能核酸的分离纯化2.3酚/氯仿抽提

酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异戊醉=25：24：1）。核酸沉淀

（1）乙醇优点：对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，不影响以后实验。缺点：需要量大，一般要求低温操作。（2）异丙醇

优点：需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。

缺点：易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数次。一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀，影响以后的实验。一般使用0℃冰水，10-15min，DNA样品足可达到实验要求。核酸的分离纯化。(1)电泳:(2)层析法:层析法是利用不同物质某些理化性质的差异而建立的分离分析方法。包括吸附层析、亲和层析、离子交换层析等方法在内的层析法。(3)密度梯度离心法:密度梯度离心也用于核酸的分离和分析。双链DNA、单链DNA、RNA和蛋白质具有不同的密度,因而可经密度梯度离心形式形成不同密度的纯样品区带,该法适用于大量核酸样本的制备。

高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)，又称高压液相色谱法、高速液相色谱法、现代液相色谱法等，是在经典液相色谱和气相色谱的基础上发展起来的分析技术。特别适用于高沸点、不能气化或热稳定性差的有机物分离分析，在生物化学与分子生物学中的应用日益广泛。HPLC在高压下使液体通过色谱柱，在室温条件下分离混合组分，经检测器转变成电信号，由记录器描记或数据处理装置显示测定结果，具有高压、高速、高效、高灵敏度等特点。(六)高效液相层析和快速蛋白液相层析1.高压：由于HPLC是以液体作为流动相，而液体比气体通过色谱柱时所受的阻力要大得多，所以必须施加高压，一般为15-30MPa，最高可达50MPa。2.高速：由于HPLC采用了高压，使流动相液体的流速加快，一般分析周期为数分钟至数10分钟，比经典的液相柱色谱要快得多，但比GC稍慢。3.高效：由于HPLC的柱效较高(每米塔板数可达5000)，有时一根柱子可分离数十种乃至上百种组分。4.高灵敏度：采用灵敏的检测器和自动化装置，可检出10-9g乃至10-11g

的物质；所需试样量很少，通常只需数十微升试样即可进行全分析。由于HPLC具有以上特点，所以70年代以来得到了迅速的发展。一般认为，对于有机物的色谱分析，当其相对分子质量小、沸点较低时，可用GC进行分析；沸点较高(＞450℃)、不能气化或热稳定性差者，可用HPLC分析；如果条件不允许，无法购置昂贵的仪器时，可用TLC等经典液相色谱进行分析。高效液相层析和快速蛋白液相层析六、蛋白质含量分析和纯度鉴定（一）

含量的测定

1.凯氏定氮法：2.双缩脲法3.紫外线吸收法

4.福林—酚试剂法紫外吸收法的优缺点：优点：简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中(特别是在柱层析分离中)广泛应用。缺点：(1)对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差，(2)若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。

4.福林—酚试剂法：a福林—酚试剂包括两组试剂：碱性铜试剂和磷钼酸和磷钨酸的混合试剂b碱性铜试剂与蛋白质产生双缩脲反应c反应后的蛋白质的酚基在碱性条件将磷钼酸和磷钨酸还原为蓝色的钼蓝和钨蓝，蓝色的深浅与蛋白含量质成正比(在650nm比色测定)。五种蛋白质测定方法比较如下：650nm560nm

（二）

蛋白质纯度的鉴定蛋白质纯度鉴定通常采用物理化学的方法：（1）电泳：目前采用的电泳分析有等电聚集、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和SDS—PAGE、毛细管电泳等。纯的蛋白质在一系列不同的pH条件下进行电泳时，都将以单一的速度移动，它的电泳图谱只呈现一个条带(或峰)。（2）离心沉降：纯的蛋白质在离心场中，应以单一的沉降速度移动

蛋白质纯度的鉴定（3）HPLC：常用于多肽、蛋白质纯度的鉴定。纯蛋白质样品在HPLC的洗脱图谱上呈现出单一的对称峰。（4）溶解度分析：（5）N—末端分析也用于鉴定纯度，因为均一的单链蛋白质样品中，N端残基只可能有一种氨基酸。

氨基酸及蛋白质理化性质的鉴别测定蛋白质分子相对质量的方法小结沉淀蛋白质的方法蛋白质的纯化分离（1）蛋白质的纯化分离（2）反应名称试剂颜色有关基团范围米伦反应HgNO3、Hg(NO3)2及HNO3混合物红色Tyr黄色反应浓HNO3及NH3黄色、橘色Tyr、Phe乙醛酸反应(Hopking-Cole反应)乙醛酸试剂及浓H2SO4紫色Trp蛋白质的颜色反应蛋白质的颜色反应反应名称试剂颜色有关基团范围茚三酮反应茚三酮蓝色自由氨基及羧基α-氨基酸坂口反应(Sakaguchi反应)α-萘酚、NaClO红色胍基Arg酚试剂反应(Folin-Cioculteu反应)碱性CuSO4及磷钨酸-钼酸蓝色酚基Tyr双缩脲反应NaOH、CuSO2紫色或粉红色二个以上肽键所有蛋白质思考题思考题思考题3．一个蛋白质混合物含有下面几种不同的组分：

a、Mr＝12，000pI=10；b、Mr=62，000pI=4c、Mr＝28，000pI=7；d、Mr=9，000pI＝5

不考虑其他因素，分别指出在下述情况下被洗脱的顺序。

①该混合物用DEAE-纤维素柱层折时，以逐渐增高洗脱液的盐浓度方式进行洗脱。

②该混合物用SephadexG-50凝胶柱层析分析。思考题分析：①DEAE-纤维素是一种常用于蛋白质分离的阴离子交换剂。在分离蛋白质样品之前，DEAE-纤维素先用较低的离子强度和pH为8的缓冲液平衡，蛋白质样品也溶于同样的缓冲液中。在这样的条件下，DEAE-纤维素大部分解离，并且带固定的正电荷。在这种pH下，蛋白质样品中各组分带净正电荷（但有差异，或带相反性质的电荷），这些带不同电荷的组分与DEAE-纤维素的结合力不同。洗脱液的离子强度影响带电颗粒与交换剂间的结合力。当升高洗脱液的离子强度时，会降低交换剂与被分离组分的静电吸引力。由上所述，该蛋白质混合物各组分被洗脱下来的先后顺序是:a>c>d>b。思考题分析：②Sephadex是葡聚糖凝胶，它是具有不同交联度的网状结构，其颗粒内部的孔径大小可以通过控制交联剂与葡聚糖的比例来达到．因此它具有筛分效应．用它作为填充料制成层析柱，可以根据被分离物质的大小进行分离。已有不同型号的葡聚糖凝胶用于不同物质的分离。当蛋白质混合样品随洗脱液向下流动时，比凝胶颗粒孔径大的蛋白质分子不能进入凝胶网格内，被排阻在凝胶颗粒的外部；比凝胶颗粒孔径小的蛋白质分子则能进入到网格内部。其结果是，分子大的蛋白质则随着洗脱液直接从柱上流出，分子比较小的蛋白质则因走了许多‘弯路”而被后洗脱下来。分子愈小，“弯路”走得愈多，洗出的速度愈慢。根据这一原则，上述蛋白质混合物从SephadexG–50洗脱出的顺序是：b>c>a>d。

思考题4、一种分子量为24,000、pI为5.5的酶被一种分子量类似、但pI为7.0的蛋白质和另外一种分子量为100,000、pI为5.4的蛋白质污染。提出一种纯化该酶的方案。

。

答：用凝胶过滤(即分子排阻层析)法先除去分子量为100,000、pI为5.4的蛋白质，余留下来的低分子量的含酶的混合物再用离子交换层析法分离，于是就能获得所需要的纯酶。思考题5、一个研究者分离了寡聚肽不知道序列也不知道氨基酸组成。企图用Edman降解测序列的努力均失败；反应不能进行。①推测该问题的两种完全不同的解释。②提出至少能够区分这两种可能的实验。答：①N-末端被封闭（如乙酰化）或者多肽是环状。②如果肽不是环状，应该有。可以用羧基肽酶A攻击。如果肽是环状的，应该找到某些蛋白酶切割一次，出现N-末端。思考题

6、某些多肽序列中正好每隔7个残基有一个Leu残基的重复则显示形成反平行卷曲的螺旋结构二聚体化倾向。多肽的α-螺旋一般是由3.6残基/转卷曲的，试述二聚体化的机制。在这样卷曲的螺旋中残基/转值将会是多少？答：如果螺旋弯曲而使残基/转数值变为3.5，则每2次旋转使Leu残基突出在同一侧面，这样两个多肽链上的Leu残基提供相互作用的疏水型表面。这种结构称为亮氨酸拉链。思考题思考题8．一种蛋白质按其重量含有1.65%亮氨酸和2.48%异亮氨酸，计算该蛋白质的最低相对分子质量。9．某蛋白质多肽链有一些区段为α-螺旋构象，另一些区段为β-折叠构象，该蛋白质相对分子质量为240000，多肽外形总长为5.06×10-5cm，计算多肽链中α-螺旋构象占分子长度的百分之多少？10．计算一个含有78个氨基酸残基的多肽，若呈α-螺旋状态，其长度为多少nm，若呈β-折叠结构长度为多少nm？思考题8．解：亮氨酸和异亮氨酸的相对分子质量都是131，根据两种氨基酸的含量来看，异亮氨∶酸亮氨=2.48%∶1.65%=1.5∶1=3∶2。所以在此蛋白质中的亮氨酸至少有2个，异亮氨酸至少有3个，那么：1.65%=1×(131-18)/蛋白质Mr蛋白质Mr=226/1.65%=12697。答：此蛋白质最低相对分子质量的12697。9．解：一般来讲氨基酸的平均相对分子质量为120，此蛋白质的相对分子质量为240000，所以氨基酸残基数为240000/120=2000个。设有X个氨基酸残基呈α-螺旋结构，则：X×0.15+（2000-X）×0.36=5.06×10-5×107=506（nm）计算后，X=1019；α-螺旋的长度为1019×0.15=152.9（nm）答：α-螺旋占蛋白质分子的百分比为：152.9/506=30.22%10．解：：呈α-螺旋状态时：78×0.15=11.7（nm）呈β-折叠状态时：78×0.36=28.1（nm）思考题解：（1）Val、Pro、Phe和Ile是非极性氨基酸，它们的侧链一般位于分子的内部。Asp、Lys和His是极性氨基酸，它们的侧链一般位于分子的表面。（2）Ser、Thr、Asn和Gln在生理pH条件下有不带电荷的极性侧链，它们能参与内部氢键的形成，氢键中和了它们的极性，所以它们能位于球状蛋白质分子的内部11．（1）球状蛋白质在pH7的水溶液中折叠成一定空间结构。这时通常非极性氨基酸残基侧链位于分子内部形成疏水核，极性氨基酸残基位于分子表面形成亲水面。（2）Ser、Thr、Asn和Gln虽然是极性氨基酸，但它们常常位于球状蛋白质的分子内部，为什么？思考题12、简述血红蛋白结构与功能的关系？解：蛋白质是功能性大分子。每一种蛋白质都有特定的一级结构和空间结构，这些特定的结构是蛋白质行使蛋白质功能的物质基础，蛋白质的各种功能又是其结构的表现。蛋白质的任何功能都是通过其肽链上各种氨基酸残基的不同功能基团来实现的，所以蛋白质的一级结构一旦确定，蛋白质的可能功能也就确定了。如血红蛋白的β-链中的N末端第六位上的谷氨酸被缬氨酸取代，就会产生镰刀形红细胞贫血症，使红蛋白的亚基本身具有与氧结合的高亲和力，而当四个亚基组成血红蛋白后，其结合氧的能力就会随着氧分压及其他因素的改变而改变。这种是由于血红蛋白分子的构象可以发生一定程度的变化，从而影响了血红蛋白与氧的亲和力。这同时也是具有变构作用蛋白质的共同机制。思考题是非判断题1．天然氨基酸都具有一个不对称的α-碳原子。2．天然存在的氨基酸就是天然氨基酸。3．某化合物和茚三酮反应生成蓝紫色，因而可以断定它是氨基酸或是蛋白质。4．“必需氨基酸”的含义是指：合成蛋白质必不可少的一些氨基酸5．由于各种天然氨基酸都有280nm的光吸收特征，据此可以作为紫外吸收法定性检测蛋白质的依据。6．自然界的蛋白质和多肽类物质均由L-型氨基酸组成。7．氨基酸在水溶液中或在晶体状态时都以两性离子形式存在。8．两性离子氨基酸在溶液中，其正负离子的解离度与溶液pH无关9．天然蛋白质α-螺旋及螺旋是否稳定与其氨基酸组成和排列顺序直接有关。思考题10．渗透压法、超离心法、凝胶过滤法及聚丙烯酰胺凝胶电脉法都是利用蛋白质的物理化学性质来测定蛋白质相对分子质量。11．蛋白质的氨基酸排列顺序在很大程度上决定它的构象。12．组蛋白是一类碱性蛋白质，它含有很多的组氨酸。13．当某一蛋白质分子的酸性氨基酸残基数目等于其碱性氨基酸残基数目时，此蛋白质的等电点为7.0。14．组氨酸是人体的一种半必需氨基酸。15．从某些微生物中分离得到的多肽抗菌素往往为环状肽链，并含有D-型氨基酸思考题16．双缩脲反应是肽和蛋白质特有的反应，所以二肽也有双缩脲反应。17．在一次实验中，蛋白质顺序仪可测定肽链长度为200个氨基酸残基的氨基酸顺序。18．一般说来，蛋白质在水溶液中，非极性氨基酸残基倾向于埋在分子的内部而不是表面。19．蛋白质中一个氨基酸残基的改变，必定引起蛋白质结构的显著变化。20．蛋白质变性后，其相对分子质量变小。1、错 2、错 3、错 4、错 5、错 6、错 7、对8、错9、对10、对11、对12、错13、错14、对15、对16、错17、错18、对19、错20、错 第一节活塞式空压机的工作原理第二节活塞式空压机的结构和自动控制第三节活塞式空压机的管理复习思考题单击此处输入你的副标题，文字是您思想的提炼，为了最终演示发布的良好效果，请尽量言简意赅的阐述观点。第六章活塞式空气压缩机

piston-aircompressor压缩空气在船舶上的应用：

1.主机的启动、换向；

2.辅机的启动；

3.为气动装置提供气源；

4.为