拟南芥和大肠

K基因转化大肠杆菌对盐胁迫的耐性为研究该蛋白是否具有耐盐的功能，将K基因编码区插入到原核表达载体并转化大肠杆菌中，检测转化菌的耐盐性。一、 材料和方法（略）二、 大肠杆菌表达载体的构建策略根据K基因编码区的序列及原核表达载体pBV221中蛋白翻译的起始序列设计两个引物，使K基因以正确的阅读框架插入到SD序列之后。5’-端引物，3’-端引物，两端引物中分别增添A或B酶切位点。以K的重组质粒为模板进行扩增，扩增条件为：预变性94°C5min；94°C1min，52°C1min，72°C1.5min，进行35个循环；72C保温10min。PCR产物经过A/B双酶切后，插入pBV221质粒的A/B酶切位点，得到原核表达载体pBV221-K重组质粒。用pBV221-K重组质粒转化E.coliDH5a感受态细胞后，在选择性培养基筛选挑选单菌落，提取重组质粒进行酶切鉴定阳性克隆。三、K基因在E.coli中的诱导表达及SDS挑取pBV221-K阳性克隆单菌落于LB液体培养基中，37C下过夜振荡培养（16h）;次日以1：100比例接种20ml新的LB液体培养基中，继续在30C振荡培养3h（全对数生长中期），然后迅速转移至42C摇床继续培养1—4h，诱导K基因的表达。取42C培养1—4h的菌液1.5ml,5000rpm离心5min收集菌体；用50pL的无菌水使菌体沉淀悬浮后，再加入等体积的2x蛋白提取缓冲液，煮沸5min后，12000rpm离心1min，上清液直接用于的SDS分析。电泳1h，然后用考马斯亮蓝染色。六、转化大肠杆菌的耐盐分析E.coliDH5a及pBV221和pBV221-K转化E.coliDH5a，经42C温度诱导4h后，将其菌密度调节至相同的OD600值，划线于含不同浓度的氯化钠的LB固体平板培养基基，因在拟南*的象达及瑞盐性分。为了评价K在植物抗盐过程中的作用，采用农杆菌转化方法将K基因转入拟南芥中，并使之过量表达，分析转K基因拟南芥对氯化钠的抗性。一、 材料和方法（略）二、 植物表达载体的构建及农杆菌的转化用M和N分别双酶切，分别回收J和K基因，将二者连接，得到植物表达载体J：:K，用直接转化法转化根癌农杆菌：1、 保存的根癌农杆菌活化后，划板，28C培养2天后长出单克隆；2、 挑取根癌农杆菌单克隆接种于50mlLB液体培养基中，28C，220rpm振荡培养至OD600=0.53、 5000rpm离心5min，弃上清；菌体用10ml预冷的0.15M的NaCl重悬；4、 5000rpm离心5min，弃上清；沉淀用1ml预冷的20mM的CaCl2重悬；5、 取200pL感受态细胞中加入卬g重组质粒，冰浴30min;6、 液氮中冷冻1min;37C水浴，融化细胞2-3min;7、 加1mlLB,28C轻轻振荡2-4h;轻轻离心1min,用0.1mlLB悬浮沉淀，将细胞悬浮涂布于含50pL/ml卡那霉素，40pL/ml利福平的LB平板上，28C培养2-3天；8、 筛出的克隆接种于液体培养基中培养，提质粒进行检测。三、 农杆菌质粒的提取与鉴定3ml上述农杆菌菌液，8000rpm离心1min，弃上清。质粒提取同大肠杆菌的提取步骤。但70%乙醇洗涤后，溶于15plTE中。取卬L用K两端特异引物进行PCR扩增；取8pL用M，N进行酶切验证。验证后的单克隆扩大培养后，用于转化拟南芥。四、 渗透法转化拟南芥1、 拟南芥的生长：拟南芥种子播种于盛满培养土的直径7cm的培养杯中，用一纱网覆盖，萌发2-3天后移至4°C光照培养箱中放置一周（进行春化），再放到21°C的组织培养室中生长。植株长出顶生花序时，去除其顶生花序，以刺激叶生花序的生长，注意避免伤及叶生花序。待叶生花序长出，其下部的花出现授粉现象时进行转化。转化前，将已授粉花及荚果除掉。2、 菌液的准备挑取鉴定好的农杆菌单克隆放于20ml含有100mg/1利福平;50mg/l硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，28C，250rpm震荡培养至OD600为0.5左右。在转化前一天，转入含50件^g/mL卡那霉素LB培养基的大瓶培养过夜，第二天，当菌液OD600在1.2一1.6之间时取出使用。3、 渗透转化：制备好已转化了K植物表达载体质粒的农杆菌菌液100mL，室温，5000rpm离心15分钟，弃上清，沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基中，重悬后的菌液OD”。600在0.8左右。将农杆菌悬浮液倒在小烧杯中，将长有拟南芥的培养杯倒扣其上，保证莲座叶以上部分浸没于液体中，浸泡15分钟。取出植株，横放在塑料盘中，用保鲜膜封好以保持湿度，放在恒温室培养。第二天打开，竖直培养，仍用保鲜膜保持湿度3一4天。根据情况可再浸染一次。培养三至四周，待种子成熟后，收取种子，干燥器中存放2周，4C春化约一周。4、 转化子的筛选：种子消毒:先用70%的乙醇浸泡2分钟，再用10%（体积比）NaClO溶液涡旋洗涤15分钟，无菌水漂洗5次，用0.1%的琼脂重悬浮种子，均匀分散到固体筛选培养基表面上，4C春化一周，放入恒温组织培养室培养。大约两周后，即可区分转化株与未转化株，转化株移栽到土中以收取T1代种子。五、 转化子的遗传分析为得到纯合的转基因株系，转化株要自交三代以上。取上T1代种子，表面消毒后播种于30mg/l含硫酸卡那霉素的固体筛选培养基上，萌发两周后，统计绿苗和黄苗的分离比例（T2代分离比），绿苗移栽到土壤中，恒温培养全成熟，单株收取种子。每株收取的种子（至少100粒）分别播种于3Omg/l含硫酸卡那霉素的固体筛选培养基上，在平板上生长全为绿苗的为含至少一个插入位点的转化株，为纯系。每一株系至少进行20单株的分析。六、 转基因植株的PCR检测取一片拟南芥叶片（小于2mmX2mm），放到含有40pL0.25NNaOH的0.5mL离心管中，在沸水浴中煮30秒。加入40pL0.25N盐酸，20pL缓冲液，沸水浴煮2分钟。13000rpm离心1分钟，弃上清，剩余组织用作PCR反应模板，每个离心管中加入50pL反应混合液。PCR完毕后，电泳检测。七、 转基因植物基因组Southern鉴定拟南芥基因组DNA提取:取各转化株系3-4片幼叶0.2g，放于1.5ml离心管中，液氮研磨，加入600pL裂解液混匀，1300rpm离心5min.弃上清，70%乙醇洗涤沉淀，室温风干，溶于30pL灭菌的双蒸水，取20pL进行southern分析。选用在K基因序列中没有酶切位点的限制性内切酶N进行酶切。另一张膜上的基因组经M和N双酶切，用于杂交。八、 转基因植株的Northern杂交为验证外源基因进入拟南芥基因组后是否己经表达，对转基因植株的RNA进行杂交验证。RNA的提取用异硫氤酸胍方法进行，杂交同上。九、 转基因植株的萌发实验和生长情况T3代纯合株系种子消毒后，种于10mM，100mM，200mM氯化钠基本培养基上。9cm培养皿大约放100粒种子，培养7天后统计萌发率，萌发标准为:胚根伸长5mm以上。实验重复两次（种子批次不同）。十、盐胁迫处理种子直接播种于土中，Hogland营养液浇灌。培养19天后，氯化钠梯度处理，每四天处理一次，每次递增50mM，处理浓度由50mM到200mM，对照正常浇灌Hogland营养液。观察生长情况，200mM氯化钠处理六天后，地上部分和根部分别取样，用于离子测定。连续的氯化钠处理，观察