斑玉孢菌丝体生长速度及产酶规律研究

斑玉孢菌丝体生长速度及产酶规律研究

在蘑菇的栽培过程中，培基材料主要包括木质素的棉碗、锯末等，木质素的分解率是蘑菇生长的最重要的减速步骤之一（berry等人，1987）。这个问题的存在严重影响了真菌天然木材资源的利用（freitgandmorter，1992）。食用菌对木质素的降解是菌丝分泌胞外酶作用的结果,主要包括木素过氧化物酶(LiP)、依赖于锰的过氧化物酶(MnP)和漆酶(Laccase)(陈素华2005)。食用菌木质素降解酶系高效降解食用菌培养基质中的木质素,为食用菌菌体的生长提供营养,促进菌体的生长发育,同时酶活力的高低可以衡量菌丝的代谢能力(张渊等2005)。酶活力反映菌株对基质的降解能力,影响食用菌的生产周期,如在利用木屑、秸秆栽培草菇、双孢蘑菇等食用菌时由于原料中木质素的存在、本身缺乏木质素降解酶导致基质利用率低、菌丝生长慢、出菇慢(宋安东等2006)。另据周光龙和余大廷(1992)报道漆酶在食用菌中还具有抑制杂菌生长、影响菇类的产量和品质等生理功能。木质素降解酶系在营养受限的次生代谢期间产生,营养、通氧量等培养因素会显著影响酶的形成(司静等2011a,2011b,2011c)。因此,探索各可控条件对食用菌酶活的影响,对提高食用菌对木质素的降解利用、缩短食用菌栽培周期、提高生物学效率具有重要意义。斑玉蕈Hypsizygusmarmoreus(Peck)H.E.Bigelow又名玉蕈,属伞菌目Agaricales,口蘑科Tricholomataceae,玉蕈属Hypsizygus,它不仅形态美观,质地脆嫩,味道美味独特,是一种高蛋白、低脂肪、低热量的食用兼药用的珍稀名贵食用菌(郑峻等2006)。自20世纪80年代在我国开始商品化种植以来,现已成为全国食用菌工厂化生产的重要品种之一,主要在上海、山西、河北、河南、山东及福建等省市推广栽培。但斑玉蕈在生产过程中存在许多问题,如生产周期较长(120–150d)、菌体的生长速度较慢、原料的利用率低,从而增加了生产成本,影响了生产企业的效益(胡开辉和出小平2008;孙淑静等2010)。本实验通过不同营养条件下斑玉蕈的菌丝生长及与基质利用相关酶的产酶特性研究,了解不同营养条件对菌丝生长特征及酶活变化规律的影响,为斑玉蕈改变营养条件调节菌丝生长速度、菌丝形态以及基质降解提供理论依据,同时对斑玉蕈栽培过程中基质的高效利用、缩短生长周期、降低生产成本具有指导意义。1材料和方法1.1材料表面1.1.1试验中的菌株1.2方法1.2.1平板接种菌生长特性观察将菌株分别接种于完全培养基、低氮培养基、高氮低碳培养基、高无机盐培养基、三低培养基、吐温20培养基,每种培养基的平板接种菌块(d=1.5cm)做3个重复,置于24℃恒温培养箱中培养,从第4天开始每隔1d测其菌丝生长速度,并观察其形态特征。1.2.2粗酶液的提取将待测菌株分别接入以上6种液体培养基中,每瓶10片(d=1cm),每种培养基的平板做3个重复,24℃,110r/min恒温振荡培养,从第4天开始每隔1d提取一次发酵液,10000r/min离心5min,取上清液,即为粗酶液。1.2.3粗酶液ph采用ABTS法定量测定漆酶活性,HAc‐NaAc缓冲液(pH4.5)2.7mL、1mmol/LABTS溶液0.1mL、粗酶液0.2mL。测定420nm处,反应开始前3min的吸光值的增加,以灭活15min的粗酶液作为空白对照。1.2.4化合物3的合成采用愈创木酚法测定锰过氧化物酶活性,1.5mL酶液,含有终浓度为0.4mmol/L的愈创木酚,0.1mmol/L的H2O2,0.2mmol/L的MnSO4及50mmol/L的琥珀酸钠缓冲体系(pH4.5),以0.1mmol/L的H2O2启动反应。测定465nm处,反应开始前3min的吸光值的增加,以灭活15min的粗酶液作为空白对照。1.2.5木质素过氧化物酶(LiP)酶活测定(荚荣等2004):0.2mol/L酒石酸钠缓冲液(pH3.0)1.5mL,15mmol/L藜芦醇1.0mL,酶液0.6mL,以15mmol/LH2O20.1mL启动反应。测定310nm处,反应开始前1min的吸光值的增加,以去离子水作为空白对照。1.2.6粗酶液对粗酶液的消化作用在具塞试管中加入(50±1)mg滤纸、1mL酶液和1mL100mmol/LHAc‐NaAc缓冲液(pH4.6),置于50℃恒温水浴锅中保温1h,取出后立即加入3mLDNS溶液,沸水显色5min,冷却至室温,加蒸馏水定容至25mL,测其520nm处OD值,以灭活15min的粗酶液作为空白对照。1.2.7粗酶液对粗酶液的消化作用在具塞试管中加入1%木聚糖溶液1.5mL、酶液0.5mL,置于50℃恒温水浴锅中保温20min,取出后立即加入3mLDNS溶液,沸水显色5min,冷却至室温,加蒸馏水定容至10mL,测其550nm处OD值,以灭活15min的粗酶液作为空白对照。2结果与分析2.1培养基上的生长速度和生长速度菌株在不同培养基上的生长速度差异较大,在低氮低碳低无机盐培养基(三低培养基)上的生长速度最快,其次是完全培养基,菌株在低氮培养基上和高无机盐培养基上的生长速度比在完全培养基上的生长速度稍慢,在高氮低碳培养基上的生长速度比较慢,在加有吐温20的培养基上生长最慢。说明碳源、氮源以及无机盐的含量对菌丝的生长有很大的影响,适量的碳源、氮源和无机盐能提高菌丝的活力,可以促进菌丝的生长,而吐温20对菌丝的影响最明显,能抑制菌丝的生长(表1)。2.2培养基上的植物病原菌有6个月生全菌株菌株在不同培养基上的菌丝形态特征差异较大,在完全培养基和吐温20培养基上的菌丝非常浓密、洁白,边缘十分整齐,气生菌丝较强,低氮培养基和高无机盐培养基上的菌丝次之,而高氮培养基和三低培养基上的菌丝浓密度最低,菌丝最弱,边缘也不整齐,气生菌丝也十分虚弱,(表2,图1)。2.35酶活性测定2.3.1培养基中漆酶活力变化菌株在不同培养基中漆酶活力不同,在完全培养基中漆酶持续增加;在低氮培养基和三低培养基中,漆酶活力先增加后降低,且低氮培养基中漆酶活力在第10天达到最高,三低培养基中第8天达到最高;高无机盐培养基中最先产生漆酶,之后随培养时间的增加,漆酶活力降低;菌株在高氮和吐温20培养基中不产生漆酶(图2)。2.3.2培养基中锰过氧化物酶活力变化在不同培养基中,菌株的锰过氧化物酶酶活有差异,在完全培养基中锰过氧化物酶酶活持续增加;在低氮培养基和三低培养基中,酶活力先增加后降低,且在低氮培养基中锰过氧化物酶酶活力在第10天达到最高,三低培养基中第8天达到最高;高无机盐培养基中最先产生锰过氧化物酶,之后随培养时间的增加,酶活力降低;菌株在高氮和吐温20培养基中不产生锰过氧化物酶,此结果与漆酶一致(图3)。2.3.3木质素过氧化物酶活性不同的培养基中,菌株的木质素过氧化物酶酶活不同。6种培养基中木质素过氧化物酶酶活都是先升高后降低。在完全、低氮、高氮低碳、三低培养基中,酶活都是在第8天达到最高;高无机盐、吐温20培养基中酶活力在第6天最高(图4)。2.3.4培养基中纤维素酶活性不同培养基中纤维素酶都是先升高后降低,完全培养基中纤维素酶活性最高;低氮、高无机盐、吐温20培养基中酶活力次之,并且低氮培养基中最先产生纤维素酶;高氮低碳、三低培养基中酶活力非常低(图5)。3不同营养条件对斑玉蚤的影响完全培养基上的菌丝生长速度较快,菌丝形态洁白浓密,边缘整齐,酶活相对于其他5种培养基较高,并且随培养时间的增加,酶活增加。三低培养基上的菌丝生长速度最快,但菌丝非常稀疏,边缘也不整齐,在整个生长阶段酶活活力较低。这说明此菌株菌丝对生长条件要求不苛刻,在营养元素不足的情况下也可以生长,但菌丝不够强壮,因此,此条件不利于菌株工厂化发展。低氮培养基上的菌丝生长速度较快,菌丝较洁白浓密,边缘较整齐,酶活也较高,仅次于完全培养基中的酶活活力,在低氮条件下最先产生木质素过氧化物酶,说明限氮条件可以刺激木质素过氧化物酶的产生,这与相关报道一致(Dosoretzetal.1990;Faison&Kirk1985;Keyseretal.1978)。吐温20上的菌丝生长速度最慢,生长过程中不产漆酶和锰过氧化物酶,产生的纤维素酶和木聚糖酶比低氮培养基中的酶活低,这与相关报道中吐温80能提高锰过氧化物酶的产生(赵玉萍和杨娟2006),以及胞外羧甲基纤维素酶和木聚糖酶活力(Johanetal.2003)不一致,这可能是由于吐温具有增强微生物细胞流动性的作用,在高浓度条件下,可破坏细胞膜的完整性,导致微生物生长受阻(李林和陈勇2013)。高无机盐培养基上菌丝生长速度较慢,菌丝比较稀疏,边缘也不整齐,最先产生漆酶和锰过氧化物酶,但酶活性比较低,说明无机盐能刺激漆酶和锰过氧化物酶的产生,对菌丝的强壮程度也有很大影响。高氮培养基上菌丝生长速度较慢,菌丝比较稀疏,边缘也不整齐,生长过程中酶活力非常低,不产生漆酶和锰过氧化物酶,说明高浓度的氮元素对漆酶和锰过氧化物酶有抑制作用。通过不同营养条件斑玉蕈的菌丝生长及产酶特性研究,了解不同营养条件对菌丝生长特征及酶活变化规律的影响,为提高菌株生长速度、木质素的降解利用、缩短食用菌栽培周期、降低生产成本提供重要的参考。斑玉蕈(闽真1号)Hypsizygusmarmoreus,为实验室保藏菌种。1.1.2培养基c基于Tien&Kirk(1988)培养基配制。完全培养基:葡萄糖20g、蛋白胨2g、MgSO4∙7H2O0.5g、K2HPO41g、KH2PO40.46g。低氮培养基:葡萄糖10g、酒石酸铵0.44g、KH2PO40.2g、MgSO4∙7H2O0.1g、CaCl20.01g、VB10.001g、0.02mol/L醋酸钠缓冲液(pH4.4)100mL。高氮低碳培养基:葡萄糖0.5g、酒石酸铵5g、KH2PO40.2g、MgSO4∙7H2O0.1g、CaCl20.01g、VB10.001g、0.02mol/L醋酸钠缓冲液(pH4.4)100mL。高无机盐培养基:葡萄糖10g、酒石酸铵0.44g、KH2PO42g、MgSO4∙7H2O1g、CaCl20.1g、VB10.001g、0.02mol/L醋酸钠缓冲液(pH4.4)100mL。低氮低碳低无机盐培养基(三低培养基)