温度胁迫下斑玉孢多蛋白和酶参与调控的蛋白质组学研究

温度胁迫下斑玉孢多蛋白和酶参与调控的蛋白质组学研究

蘑菇h.e.黑玉也被称为蘑菇，属于伞菌科agal，属于蘑菇科ticholomatace，属hypsijigus。目前国内外对斑玉蕈的研究主要集中在栽培育种方面,其子实体热水和有机溶剂提取物有清除体内自由基、降血压、提高免疫力和延缓衰老等功效(黄志龙和肖淑霞2002)。斑玉蕈是北温带一种优良的珍稀美味食用菌,具有发展前景。但斑玉蕈栽培生产周期长达120-140d,而且斑玉蕈是一种低温结实型食用菌,常规栽培易受环境因子的影响,造成产量不稳定,质量低劣,商品价值低,无法形成大规模产业化生产(胡开辉和出小平2008)。在斑玉蕈的生产过程中温度是直接影响其品质的主要因素之一,不同的温度明显影响斑玉蕈的发育、子实体的形状等,低温下12-14℃出菇,质地致密、脆嫩、口感好且相对储存时间较长,出菇温度高于18℃时,产品质地疏松、入口绵软,子实体菇柄大小、长短不一,且菇柄空心,影响外观,品质也明显降低。蛋白质是基因表达的产物,是生物功能的执行者,从蛋白质水平来研究斑玉蕈低温刺激的应激反应,比传统研究微生物胁迫生理的方法更能深入阐明斑玉蕈的适应性机理。在食用菌研究中目前尚未见蛋白质组学研究及双向电泳应用的报道。作者研究了斑玉蕈低温胁迫下菌丝体的保护酶活性变化及差异表达的蛋白质组学,从理论上了解斑玉蕈在环境刺激条件下的代谢途径和应答机制,为下一步克隆斑玉蕈低温诱导相关基因及了解食用菌的低温刺激结实特性提供了理论依据,具有重要的理论和实践意义。1材料和方法1.1材料表面1.1.1实验室保存真9603Hypsizigusmarmoreus,本实验室保存。PDA培养基配方:去皮马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂粉20g(液体培养基不加),定容至1L,121℃、压力0.1MPa下灭菌20min。1.1.2其它分析试剂丙烯酰胺、亚甲叉双丙烯酰胺、SDS、TEMED、溴酚蓝等购自上海生工(BBI分装);碘乙酰胺、β-巯基乙醇、载体两性电解质pH3.0-10.0和pH5.0-8.0(Biorad);NP-40、DTT、TritonX-100、胰蛋白酶等购自Sigma公司;其它均为国产分析纯试剂;仪器有电泳仪、垂直电泳槽、扫描仪、可见分光光度计等。1.2方法1.2.1液体培养基培养方将试管保存的斑玉蕈菌种先用PDA平板活化,待长满约1/3平板时,接种于PDA液体培养基中培养作为液体菌种,置于恒温往复式摇床25℃,转速140r/min摇菌,72h后将液体菌种用于扩大培养,液体培养基装液量均为100mL/250mL的三角瓶,转速和温度同前面一致,25℃培养约5d,以25℃为对照,14℃为低温处理。处理3h、6h、9h、12h、24h分别取样。每个处理设三个重复,用布什漏斗抽滤,并用蒸馏水冲洗菌丝体,存于-80℃冰箱保存。1.2.2蛋白质双向电泳采用液氮研磨,三氯醋酸TCA/丙酮法进行菌丝体蛋白质的提取,所得蛋白干粉裂解后分装于PCR管中,-20℃保存。裂解后样品用Brandford法定量(李建武等1994)。1.2.3蛋白质的双向电泳:第一向等电聚焦采用自制胶(王经源等2006),电泳按200v,300v,400v,500v,600v,各30min,800v18h,1000v3h的程序进行。第二向采用分离胶浓度10%的SDS垂直平板电泳,以15mA/gel进行恒流电泳。完成第二向电泳的胶用常规的银染色法染色。1.2.4生理生化指标的测定胶内酶解参照Bergmanetal.(2001)的方法进行。酶解样品用4700串联飞行时间质谱仪[4700ProteomicsAnalyzer(TOF/TOFTM)(AppliedBiosystems,USA)]进行质谱分析,得到各蛋白点的肽质量指纹图谱。所得结果用GPS(AppliedBiosystems,USA)–MASCOT(MatrixScience,London,UK)进行数据库检索。1.2.5生理生化指标测定:丙二醛(MDA)含量的测定采用TBA比色法。超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定采用氮蓝四唑光化还原法,以抑制光化还原反应的50%为一个酶活性单位。以上各指标测定参考《现代植物生理学实验指南》(汤章城1999)。过氧化物酶(POD)活性的测定参考张宪政(1989)的方法,以1min内吸光度变化0.1的酶量为一个酶活单位。过氧化氢酶(CAT)活性测定参考曾韶西等(1991)的方法,以1min酶转化1μmolH2O2为一个酶活单位。2结果与分析2.1蛋白质组分的分离使用pH3-10范围电解质,10%分离胶浓度来分离蛋白,蛋白质上样量170μg/胶,分离效果较好,采用银染方法,约能清晰的分离到600个左右蛋白点。从第二向胶上蛋白点分布情况来看,大多数的蛋白点集中在pH4-8之间,偏酸性蛋白较多。处理和对照之间的蛋白质组分非常相似(图1),体现了斑玉蕈生长过程中蛋白质组分的相对稳定性。但处理和对照之间的蛋白质组亦有差异。用Melanie4软件进行分析,当两两之间的差量值大于1.5时,认为具有明显差异,共鉴定到差异表达蛋白26个。2.2成功鉴定蛋白挖取差异表达的26个蛋白进行MADI-TOF-MS/MS分析与鉴定,有20个蛋白有质谱信号,但数据库搜索之后仅14个蛋白得到初步鉴定,其中有10个为表达量上调蛋白,4个表达量下调蛋白。成功鉴定的蛋白包括乙酰乳酸合成酶、微管蛋白、ATP合成酶、肌动蛋白、鸟苷酸结合蛋白、14-3-3蛋白、蛋白酶体α亚基、转醛醇酶、苹果酸脱氢酶、甲酸脱氢酶、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶和一个功能未知的预测蛋白。鉴定蛋白相关信息见表1。2.3反馈作用发挥MDA是膜脂过氧化作用的最终产物,是膜系统受伤害的重要标志之一。其含量多少可代表膜损伤程度的大小,并兼有反馈作用。如图2所示,低温胁迫3h到12h,斑玉蕈的MDA含量一直保持上升趋势,到12h达到最大值,之后开始下降,但一直高于对照水平,MDA的含量虽有升高,但是变化幅度并不是很大,可能是斑玉蕈对这种低温刺激有很强的适应性,能够在短时间内适应低温,并有恢复的趋势,可能这种刺激利于斑玉蕈分化发育。2.4低温胁迫对斑玉蚤抗氧化活性的影响SOD是生物体抗逆性中最重要的清除自由基的酶,主要是清除生物体内的O2-。低温胁迫下,斑玉蕈的SOD活性在处理的12h内都处于上升趋势,从12h到24h,活性下降,整个低温处理过程中其活性一直高于对照(图3),可能是低温引起斑玉蕈菌丝体内氧化还原平衡被破坏,活性氧含量增加,SOD产生应急反应,活性在短时间内迅速提高,利于有效地清除胁迫下产生的活性氧,形成适应逆境的一种新的动态的氧化还原平衡系统。POD是重要的内源活性氧清除剂,可清除生物体内的H2O2和·OH。低温胁迫下,斑玉蕈的POD的活性增加,到9h达到最大值,之后略有下降,但均高于对照(图4)。说明低温刺激下POD清除活性氧的能力增强,POD参与了斑玉蕈的低温适应性过程。与POD的功能类似,CAT也可以消除细胞中的H2O2和·OH。低温胁迫下斑玉蕈菌丝体的CAT活性也得到增强,CAT活性在12h时达到最大值,在处理的24h内均高于对照(图5)。说明低温刺激下CAT清除活性氧的能力增强,也参与了斑玉蕈的低温适应性过程。3其他基因型及分子活性的变化MDA是膜脂过氧化作用的最终产物,当细胞处于低温胁迫时,首先胞内的MDA含量升高,活性氧增加,从而造成质膜系统的伤害,发生脂质过氧化,增加了细胞膜的透性。但低温同样也诱导了胞内SOD等抗氧化酶系统,使SOD含量增加,清除产生的活性氧。本实验中发现低温胁迫下MDA含量增加,到12h含量最高,之后缓慢下降,说明低温胁迫引起了斑玉蕈的细胞膜的损伤。当食用菌遭受到温度胁迫时,使菌丝体内超氧阴离子等活性氧产生速率增加,引起结构和功能上的损伤,而此时,机体内以超氧物歧化酶(SOD)为中心的抗氧化酶系统发生应激性变化,缓解逆境胁迫的伤害。斑玉蕈在低温胁迫下的SOD、CAT、POD活性都比对照高,MDA含量也增加,表明低温胁迫造成斑玉蕈的细胞损伤。保护酶和MDA的含量变化具有一致性,在胁迫初期上升较快,约12h后都逐渐下降,说明斑玉蕈在14℃胁迫下很快产生适应性,也许正是这种胁迫促进了斑玉蕈的细胞进一步分化。在鉴定的差异蛋白中,1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(简称RubisCO)是调节光合和光呼吸、决定净光合的一个关键酶。植物叶片对环境变化的响应中RubisCO可能是一个主要的生理功能限制部位(由继红等2002)。Makinoetal.(1997)研究发现植物为了适应高CO2浓度、低温、低光照的环境,致使RubisCO活性和含量均下降;干旱胁迫引起芦苇中RubisCO酶活性降低,但酶含量不变,而盐生环境不引起活性降低,但酶含量下降(陈为钧等1999);在盐胁迫诱导雨生红球藻合成虾青素机理的研究中发现HS中硝酸还原酶(NR)和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RubisCO)活性迅速下降(董庆霖等2007)。由此可见RubisCO可能通过含量和酶活的改变参与环境胁迫的应答。鉴定到一个表达量下调的RubisCO,可能通过呼吸作用的减弱,参与了斑玉蕈的低温适应性应答过程。脱氢酶是植物抗寒性研究的一个重要生理指标。脱氢酶活性随处理温度降低而下降,说明斑玉蕈的呼吸代谢随温度降低而减弱。既减少有机物消耗;又造成整体代谢强度减弱,抗逆性增强。此外,斑玉蕈的生长也需要适当的CO2浓度,这可能与菌种的遗传特性有关。肌动蛋白和微管蛋白是真核生物细胞骨架的重要成分,在控制细胞分裂、细胞生长和形态以及细胞内运输等方面扮演重要角色(Stotz&Long1999;Munozetal.1998)。Munozetal.(1998)发现微管蛋白基因的表达水平与植物的生长速率是正相关的。鉴定到两个肌动蛋白,其表达量在低温胁迫下均上升,推测可能是低温诱导斑玉蕈菌丝体细胞内微管解聚,进而引起细胞形态的变化,促进了细胞的分化发育,利于原基的形成。14-3-3蛋白几乎参与生命体所有的生理反应过程(文彬和王小菁2004)。14-3-3蛋白在细胞信号转导、细胞周期的调控、转录因子对环境的应答及细胞的凋亡等生理过程中起着重要的作用。另外14-3-3蛋白还可以与磷酸化的H+-ATP酶的β亚基相结合,而抑制了H+-ATP酶的活性,参与了新陈代谢活动(孔令印和张耀洲2007)。不同的14-3-3蛋白同工型具有不同的细胞特异性,调控发育表达、应答不同环境刺激(崔娜等2007)。一些14-3-3蛋白可被低温、低氧、高盐、病原菌侵染等诱导,14-3-3蛋白也在低温胁迫、高盐胁迫、机械损伤等应答上起作用,但目前对这些方面的认识还非常有限。低温胁迫下斑玉蕈14-3-3蛋白表达量增加,表明14-3-3蛋白可能参与其低温胁迫应答的多方面的功能调控,但其具体功能有待于进一步研究。ATPB_KLULA(ATPsynthase)是线粒体前体,一种ATP合成酶。F1F0-ATP合成酶复合物(ATP合成酶)在生命有机体ATP的合成过程中起到了极为重要的作用。它参与氧化磷酸化与光合磷酸化的反应,催化合成生物体的能量“通货”—ATP(张欣欣和柳参奎2003),是参与能量代谢的关键酶之一。线粒体ATP合成酶是负责细胞中能量代谢中ATP生产的一种关键酶,而能量代谢与逆境的关系是一个值得