mda、sod及nf-在实验性胰性脑病中对大鼠脑组织的作用

mda、sod及nf-在实验性胰性脑病中对大鼠脑组织的作用

胰腺疾病（pe）患者的特征是在胰腺疾病发生时具有独特的精神障碍。并发症危险，死亡率高，但发病机制尚不完全清楚。目前对PE发生机理普遍的理解是胰酶进入血液循环,通过血脑屏障引起脑损害,其中磷脂酶A2(PLA2)的作用引人注目。PLA2活化后可将胆汁内卵磷脂转化成溶血卵磷脂,后者有破坏细胞膜磷脂层的特性,通过血脑屏障引起脑细胞脱髓鞘改变。本研究通过建立PE动物模型,观察其脑组织病理改变情况并检测脑组织丙二醛(MDA)、肿瘤坏死因子(TNF)-α含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性,以揭示MDA、TNF-α对脑组织的损害作用和SOD的保护作用,从而进一步阐明PE发病机理,旨在为以后的临床治疗提供依据。1材料和方法1.1分组及分组方法Wistar大白鼠36只,从内蒙古大学动物中心购买,体重200～260g,雌雄不拘,应用拆信封法随机分组:对照组6只;PE组30只,PE组再按照完全随机化原则分成3个亚组,即第1d组、第3d组及第7d组,每组10只。各组动物于实验前12h禁食,自由饮水。1.2麻醉大鼠造模前后脑主动脉放血分血法见表1PE组参照苗毅等的方法从颈内动脉注入精致猪活性PLA2(Sigma公司)复制大鼠PE模型,PLA2(0.1ml/100g体重)1000U/0.1ml,速度为0.05ml/min;对照组注入生理盐水0.1ml/100g体重,速度为0.05ml/min。对照组大鼠于造模后第1d用1%氯氨酮(1ml/100g体重)腹腔注射麻醉后,腹主动脉放血处死取脑;PE组分别在造模后第1、3、7d同法各处死10只大鼠取脑。1.3脑干重、脑含水量检测采用干重、湿重法测定:将新鲜取得鼠脑的部分枕叶用电子天平直接称湿重,然后放在80℃烤箱中36h烤干,测鼠脑的干重,脑组织含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。1.4脑梗死超早期溶剂复合体中tnf-含量的测定取部分额叶脑组织按重量∶冰生理盐水体积的比(W/V)=1∶4常规制备20%的匀浆。用双抗体夹心ELISA法测定脑组织匀浆中TNF-α的含量(试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司生产),按试剂盒操作说明的方法进行;采用化学比色法检测脑组织匀浆中MDA含量及SOD活性(试剂盒由南京建成生物工程研究所生产),按试剂盒操作说明的方法进行。1.5脑微血管及髓样的观察和测定①常规HE染色,参照孔雷等的大鼠脑组织观察内容及脑损伤评价方案进行镜下观察;光镜下观察20个脑微血管断面,并计数20个断面内聚集和附壁的白细胞总数,求每组的均数。②采用砂罗铬花青法对脑组织髓鞘行特殊染色,试剂盒购自广州俪科贸易有限公司,操作按说明书进行。垂直中线切片,片厚5μm,正常神经髓鞘染为蓝色。1.6统计处理采用SPSS11.0软件,数据采用ˉx±s表示,统计方法用重复测量方差分析。检验水准α=0.05。2结果2.1大鼠造模前后的一般情况对照组大鼠麻醉清醒后即开始进食,活动不受影响;PE组大鼠于造模后第2d开始表现为进食减少、活动减少、反应迟钝、抓捕反射减弱,但随着时间的延长,至第7d上述表现没有明显加重。2.2pe组与对照组脑水肿情况大鼠脑组织的含水量PE组从造模后第1d开始就明显高于对照组(P<0.05),表明存在脑组织水肿,且随时间推移脑组织含水量逐渐增加,但是PE组3个时相的脑组织含水量比较,差异无统计学意义(P>0.05),见附表。2.3延长tnf-和mda含量脑组织匀浆TNF-α、MDA含量PE组从造模后第1d开始就明显高于对照组,随着时间的延长TNF-α、MDA含量和对照组比较一直维持在较高的水平(P<0.05,P<0.01);SOD则下降较明显(P<0.05)。PE组MDA和SOD3个时相间比较,差异无统计学意义(P>0.05),而第7d的TNF-α含量明显高于第1d(P<0.05)。见附表。2.4结果显示的脑组织病理变化2.4.1大鼠神经元细胞水肿对照组大鼠脑组织可见散在的神经元细胞水肿,脑组织内没有炎性细胞的增生、聚集,脑组织的微血管内有少数的白细胞附壁。PE组大鼠神经元细胞水肿于造模后第1d即开始出现,随着时间的延长,镜下改变表现为神经元细胞水肿加重,呈气球样变,由较局限的神经元细胞水肿到广泛的神经元水肿,染色质边聚;微血管内白细胞发生聚集及附壁,其数目也随着时间的延长而增加(P<0.01),见附表;脑组织内炎性细胞的增生、聚集于第1d即开始出现,至第3、7d更加明显,小血管内皮细胞出现肿胀。见图1A～1D。2.4.2造模前后脱髓形态变化对照组无脱髓鞘改变,染色为鲜蓝色;PE组造模后第1d脱髓鞘改变不明显,从第3d开始出现脱髓鞘改变,蓝色变浅,第7d最为明显。见图2A、2B。3脑损伤活性测定结果近年来人们逐渐认识到胰酶中的PLA2不仅是引起急性胰腺炎时胰腺坏死的主要物质,而且是导致PE的重要物质,PLA2使胆汁内的卵磷脂与脑磷脂转变成溶血卵磷脂和溶血脑磷脂。溶血卵磷脂有强烈的嗜神经性和较强的细胞毒性,能破坏细胞膜的磷脂层,导致细胞代谢障碍,影响细胞通透性,并可透过血脑屏障进入脑循环,直接引起脑组织水肿、出血、软化、坏死以及神经细胞的脱髓鞘病变,本研究参照苗毅等的方法从颈内动脉注入精致猪活性PLA2(Sigma公司)直接成功复制大鼠PE模型。PE时中性粒细胞被激活,耗氧量明显增加,产生大量的氧自由基(oxygenfreeradical,OFR),如不能及时清除将引起脂质过氧化作用,形成脂质过氧化物。MDA是脂质过氧化物中的主要代谢产物,对细胞的多种成分有损伤作用,并由此引起一系列的细胞结构和功能的破坏。因此,测定MDA常常可反映机体内脂质过氧化的程度,间接地反映出细胞损伤的程度。在正常生理状态下体内OFR不易发生蓄积和过氧化损伤,其中SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用,此酶能清除超氧阴离子自由基,保护细胞免受损伤。SOD活性的高低间接反应机体内清除OFR的能力,常作为清除OFR能力的主要指标。本实验结果显示,PE大鼠脑组织MDA含量明显升高,SOD活性显著降低,并且随着时间的延长,MDA一直维持在较高的水平,而SOD活力一直处于较低水平,说明MDA在PE发病的7d内对脑组织的损害一直在起作用。MDA在SAP伴发脑组织损害发病机理中可能起重要作用。PE大鼠脑组织SOD活性降低,MDA含量增高,MDA通过血脑屏障积聚于脑组织,而使脑组织逐渐产生水肿及神经脱髓鞘改变,随着时间延长而加重,并出现髓鞘变性改变。脑组织OFR清除剂SOD活性下降、MDA含量增加,引起脂质过氧化增强,证明其参与PE脑组织损伤的发生、发展。PE脑组织中OFR代谢产物MDA增高的可能机理:①胰酶可激活黄嘌呤氧化酶,后者催化次黄嘌呤产生OFR,透过血脑屏障而损害脑组织。②PLA2、炎性介质和损伤的血管内皮细胞均可活化血小板,释放OFR。③PE晚期随着多系统器官功能衰竭的发生,脑组织进一步被破坏并继发微血管血栓形成,加剧脑组织缺氧,产生的OFR加重脑损害。细胞因子主要由机体的免疫细胞分泌,是一类与免疫活化和炎症反应有重要关系的可溶性多肽。正常情况下,人体细胞因子含量极低,但在各种因素刺激如感染、外伤后,其表达可急剧增加,过度表达可导致或加重组织损伤。细胞因子与脏器细胞受体结合发挥生物学效应,同时又可与循环的可溶性受体结合再次引发细胞因子过度释放。重症急性胰腺炎(SAP)伴发中毒样症状与细胞因子过度产生引起脏器和功能损害密切相关,参与的细胞因子主要有TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1等。本实验中,PE大鼠模型建立后,脑组织中TNF-α含量于第1d即明显升高,并且随着时间的延长TNF-α一直维持在很高的水平并且有增高的趋势,说明TNF-α在PE发病的7d内对脑组织的损害一直在起作用,且随着时间的延长,TNF-α含量逐渐增加,脑组织损害也逐渐加重,表现为白细胞附壁数目增加和神经纤维脱髓鞘改变的加重。TNF-α主要由活化的单核细胞产生,是天然免疫和特异性免疫的重要介质,又是参与特异性免疫和炎症反应的重要因子。TNF-α低浓度时其是防御病原微生物的重要因素,浓度过高则可导致一系列炎性损害。TNF-α是免疫宿主反应的快速反应因子,在免疫疾病中有病理性作用。TNF-α是SAP过程中介导脑组织损害的重要炎性介质之一,主要机理有:①TNF-α可刺激PLA2的分化,也可直接激活PLA2;②TNF-α可促进多核白细胞的积聚和激活,激活的白细胞在TNF-α作用下可释放增强毛细血管通透性的细胞介质,这些介质包括血小板活化因子、IL-6、IL-2、IL-8、一氧化氮、血栓素A2、前列腺素、OFR等,炎性介质又可正反馈促进TNF-α等细胞因子产生,从而形成“瀑布”样级联反应;③TNF-α既可直接诱导血管内皮细胞的通透性增加,也可间接通过白细胞发挥作用;④TNF-α对血管内皮的黏附分子有上调作用,黏附分子向上调节可促进白细胞黏附和收缩,造成毛细血管渗漏和组织损害;⑤TNF-α介导髓鞘的炎性损伤,刺激免疫细胞活化,造成对髓鞘的破坏,也可直接对髓鞘产生毒性破坏作用;⑥刺激血小板活化因子生成,诱导脑微血管血栓形成及内皮细胞的破坏。TNF-α抗体能减