硼替佐米对伯基特淋巴瘤Raji的体外治疗作用

硼替佐米对伯基特淋巴瘤Raji的体外治疗作用李靖1，闫明明21.河南省洛阳职业技术学院，河南洛阳，4710022.河南科技大学第一附属医院，河南洛阳，471002摘要：【目的】探究硼替佐米对伯基特淋巴瘤Raji细胞体外治疗作用及其可能机制。【方法】MTT实验检测硼替佐米对淋巴瘤Raji细胞活力的影响；Westernblotting实验和RT-PCR实验检测硼替佐米对Raji细胞中NF-kBp65表达和Caspase-3剪切的影响。【结果】MTT实验表明硼替佐米抑制Raji细胞活力，并且其抑制作用呈剂量、时间依赖性(PvO.05)；Westernblotting实验和RT-PCR实验显示硼替佐米显著抑制Raji细胞NF-kBp65表达并且促进caspase-3的剪切(Pv0.05)。【结论】硼替佐米能够抑制Raji细胞增殖，机制可能与抑制NF-kB(P65)激活和上调cleaved-caspase-3表达有关。【关键词】硼替佐米；淋巴瘤；NF-kBThetherapeuticeffectofBurkittbortezomibonlymphomaRajiinvitroLiJing1,YanMing-ming21:LuoyangVocationalCollegeofTechnology,Luoyang471002,China2:FirstAffiliatedHospitalofHenanUniversityofScienceandTechnology,Luoyang471002,ChinaAbstract:Objective:ToexploretherapeuticeffectofbortezomibonBurkittlymphomaanditspossiblemechanism.Methods:TheeffectofbortezomibonhumanlymphomaRajicellsproliferationwasdeterminedbyMTTassay.TheexpressionofNF-kBp65andCleaved-caspase-3proteinweredetectedbyWesternblotting.NF-kBp65andCleaved-caspase-3mRNAexpressionweredetectedbyRT-PCR.Results:ThedatashowedthatbortezomibinhibitedRajicellsproliferationandtheinhibitionratewererelatedinadose-dependentmannerandatime-dependentmanner(P<0.05).WesternblottingdataindicatedthattheexpressionofNF-kBp65wasdecreasedandtheexpressionofCleaved-caspase-3wasincreasedafterbortezomibtreatmentinadosedependentmanner(P<0.05).RT-PCRdatademonstratedthatthemRNAexpressionofNF-kBp65wasdecreasedandthemRNAexpressionofCleaved-caspase-3wasincreasedafterbortezomibtreatmentinadosedependentmanner(P<0.05).Conclusions:BortezomibcaninhibitRajicellsproliferationmayviadownregulatingtheexpressionofNF-kBandupregulatingtheexpressionofCleaved-caspase-3.Keywords:Bortezomib;lymphoma;NF-kB伯基特淋巴瘤(Burkittlymphoma,BL)，属于B淋巴细胞性的非霍奇金淋巴瘤(NHL),常发于儿童和青少年，很少在中年人群中发现［1］。70%-80%高速增殖的BL发生染色体易位［2］，染色体易位导致致癌基因和c-Myc基因过表达以及组成性激活，导致细胞形状转化，细胞增殖失控［3］。目前，BL化疗包括环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、阿糖胞苷和利妥昔单抗针对性治疗，虽然在儿童患者取得了一定的治疗效果，然而对青少年患者来说依然存在预后较差现象［4,5］。因此需要有更有效的化疗药物提高淋巴瘤的治疗效果。异常NF-kB激活以及促增殖和抗凋亡基因的高表达，是多种恶性淋巴瘤主要特征之一，如霍奇金淋巴瘤与非霍奇金淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤。有研究证实,NF-kB参与调控B、T淋巴瘤细胞增殖基因cyclinD1和c-Myc和抗凋亡基因(Bcl-2,Bcl-xL)激活⑹，且与淋巴细胞发生、发展和增殖相关［刀。另外，c-Myc可以通过NF-kB信号途径抑制免疫系统导致伯基特淋巴瘤免疫缺陷［8］。这些研究暗示以NF-kB为靶标的药物可能用于治疗伯基特淋巴瘤。硼替佐米(Bortezomib,BZ)是FDA第一个批准的蛋白酶体抑制剂，可以通过抑制KBa降解，进而抑制转录因子NF-kB的激活和转位［9,可以用于套细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤的治疗［10］。然而硼替佐米治疗伯基特淋巴瘤的作用和机制尚未完全了解［11］。因此，我们研究了硼替佐米对人淋巴瘤细胞株Raji细胞的增殖的影响及其可能的机制。1实验内容主要试剂人淋巴瘤细胞株Raji细胞购自AmericanTypeCultureCollection,RPMI-1640培养基购自美国Sigma公司，胎牛血清(FBS)购自美国Invitrogen公司，NF-kBp65抗体、Cleaved-caspase-3抗体和GAPDH抗体均购自美国SantaCruze公司，抗兔和抗鼠二抗购自江苏碧云天生物研究所。引物NF-kBp65、cleaved-caspase-3和GAPDH引物由上海生工生物公司合成,NF-kBp65引物序列：forward： 5'-GTTCACAGACCTGGCATCCGT-3' ，reverse： 5'-GAGAAGTCCATGTCCGCAATG-3'；Cleaved-caspase-3引物序列：forward： 5'-GTTTGAGGACCTTCGACCAG-3'，reverse：5'-CAAAGATGTCGTCCAGGGTC-3'；GAPDH引物序列：forward:5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3',reverse:5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。细胞培养人淋巴瘤细胞株Raji细胞培养于37°C、含有5%CO2饱和湿度培养箱中，其培养基是含有10%FBS的RPMI-1640培养基，并且向培养基加入青霉素-链霉素双抗。分别向Raji细胞培养基中加入生理盐水溶解的硼替佐米，硼替佐米最终浓度分别为0、5、10、20和50nmol/L(nM)方法1.4.1MTT方法检测Raji细胞株活力将Raji细胞接种到96孔板中，每孔接种1x104个Raji细胞，在37°C、含有5%CO2饱和湿度培养箱中培养24h后，分两组实验。一组与不同浓度硼替佐米（0、5、10、20和50nM）共同孵育24h，每个浓度设置4个复孔；另外一组是用10nM硼替佐米与Raji细胞分别孵育24h、48h和72h,每个时间点设置4个复孔。之后每个组加入20plMTT工作液，在培养箱内继续培养4h,吸出培养基，加入200卩1DMSO，摇床摇晃10min充分溶解结晶物。将96孔板盖打开，放入酶标仪检测，在波长490nm处检测OD值，并做记录。，以上实验重复3次。Westernblotting实验按照实验要求用不同浓度硼替佐米（0、5、10、20和50nM）处理Raji细胞24h后，PBS洗涤细胞，加入细胞裂解液RIPA（其中含有蛋白酶抑制剂1:1000），冰上裂解30min,收集蛋白。离心（4C，12000xg/min）15min。BCA蛋白定量试剂盒定量后调整各组蛋白上样总量至30ggoSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，电转到PVDF上。室温5%牛奶封闭1h。TBST洗膜3次，每次5min。加入NF-kBp65抗体（1:2000稀释）、Cleaved-caspase-3抗体（1:1000稀释）和GAPDH抗体（1:5000稀释）4C下孵育过夜。TBST洗膜3次，每次5min。孵育相应的二抗（1:1000稀释），TBST洗膜3次，每次10min。加ECL发光液显影，用自动显影仪显影，并分析条带灰度。用自带软件扫描灰度值。RT-PCR检测按Invitrogen公司试剂盒说明书从Raji细胞提取总RNA，酶标仪测定样品在260nm和280nm处吸光度（OD）,并进行核酸定量。每个反应管加总RNA2gg，总反应体系20卩1,反应条件：42C,20min；99C,5min；4C,5min。PCR扩增体系：10x反应缓冲液10卩1,cDNA20gl,forward引物1gl,reverse引物1gl,Taq酶1gl,ddH2O27卩1。扩增条件:94,60s；60C（（NF-kBp65）58C（Cleaved-caspase-3）,30s；72C,60s；进行32个循环。然后72C,10min,4C保存。取上述扩增产物10gl,1.5%凝胶电泳在100V电压下电泳1h。凝胶成像系统显影并扫描灰度值。1.5统计分析所有实验数据采用SPSS20.0进行统计学分析。实验结果以均数土标准差（mean土SD）表示，多组数据采用单因素方差分析（ANOVA），并用Bonferroni法进行均数组间的两两比较，以PV0.05表示差异有统计学显著性。2结果2・1MTT实验检测Raji细胞活性MTT实验结果显示，不同浓度硼替佐米对Raji细胞有显著抑制作用（PV0.05），同一浓度不同时间对Raji细胞也有显著抑制作用（PV0.05）。见图1.A::;::::::::::咚菽亜;©?:•/?:■■：!&!：*：■&!时间A::;::::::::::咚菽亜;©?:•/?:■■：!&!：*：■&!时间(h)图1MTT实验检测硼替佐米对Raji细胞活性影响。A不同浓度硼替佐米与Raji细胞孵育24h后，通过MTT实验检测其活力(n=3,*Pv0.05)。B10nM硼替佐米与Raji细胞孵育不同时间后，通过MTT实验检测其活力(n=3,*Pv0.05)。2.2Westernblotting实验分析目的蛋白Westernblotting实验结果表明随着硼替佐米浓度增加，NF-kBp65表达减少，Cleaved-caspase-3表达增加(Pv0.05)。见图2.NF-kBp65Cleaved-caspase-3GAPDH图2Westernblotting实验分析目的蛋白°(n=3,*P<0.05vs0nM)。2.3RT-PCR检测硼替佐米对Raji细胞中NFkBp65和Caspase-3mRNA的影响。RT-PCR检测结果表明在硼替佐米抑制Raji细胞增殖时，伴随着NF-kBp65mRNA下调以及Cleaved-caspase-3mRNA上调，并且呈剂量依赖性(P<0.05)。见图3.5 10 20 50(r^l)C1OWC1OW虽dx(DC图3RT-PCR检测硼替佐米对Raji细胞中NF-kBp65和Cleaved-caspase-3mRNA的影响(n=3,*P<0.05vs0nM)。3讨论传统化疗占据肿瘤疾病治疗的中流砥柱，但很多化疗药物对肿瘤治疗效果并不尽人意且还经常发生毒副作用和耐药性，从而妨碍药物的临床使用。蛋白酶体是多蛋白复合物，对泛素降解起着重要的作用［12］。有报道论述，蛋白酶体活性异常会增加内质网压力，最终引起肿瘤细胞凋亡［13］。因此，抑制蛋白酶体活性已经成为研究肿瘤治疗新的方向［14］。硼替佐米是二肽硼酸蛋白酶体抑制剂，具有干扰DNA修复、诱导细胞凋亡的作用。本研究发现硼替佐米对Raji细胞活力有显著抑制作用，并且具有浓度和时间依赖性。进一步，研究发现，硼替佐米能够下调Raji细胞中NF-kB蛋白和mRNA表达，上调Cleaved-caspase-3蛋白和mRNA表达，均具有浓度依赖性。NF-kB是转录因子蛋白家族，参与调控机体免疫应答、炎症反应甚至肿瘤发生进展等多种生命进程。而吓-kB异常转位，会导致调控失衡。众多研究发现，在肿瘤细胞凋亡时，NF-kB转录受到抑制［3」5］。本研究初步表明，硼替佐米可能通过抑制iKBa降解，进而抑制转录因子NF-kB的激活和转位，最终促使caspase-3剪切，最终抑制Raji细胞增殖，从而起到治疗淋巴瘤作用。参考文献IsraelsT,vandeWeteringMD,HesselingP,etal.MalnutritionandneutropeniainchildrentreatedforBurkittlymphomainMalawi[J].PediatrBloodCancer,2009,53(1):47-52.DangCV,O'DonnellKA,JuopperiT.ThegreatMYCescapeintumorigenesis[J].CancerCell,2005,8(3):177-178.孙晓非，甄子俊，刘冬耕，等.改良B-NHL-BFM-90方案治疗儿童青少年伯基特淋巴瘤的疗效分析[J].癌症,2007,26(12):1339-1343.林宁晶，郑文，张运涛，等.13例伯基特和伯基特样淋巴瘤的临床特点分析J].中国肿瘤临床，2010，37(1):5-8.⑸杨艳.弥漫性大B细胞淋巴瘤中hENT1、NF-kB的表达及意义[D].安徽医科大学,2013.⑹李百周，叶洪涛，周晓燕•CARMA1-BCL10-MALT1,NF-kB信号传导通路与淋巴瘤[J].中国癌症杂志，2007，17(9):733-739.TafukuS，MatsudaT，KawakamiH，etal.PotentialmechanismofresistancetoTRAIL-inducedapoptosisinBurkitt'slymphoma[J].EurJHaematol，2006，76(1):64-74.李颖璐.硼替佐米治疗滤泡性淋巴