通心络胶囊对糖尿病小鼠视网膜ickisknf-b通路的影响

通心络胶囊对糖尿病小鼠视网膜ickisknf-b通路的影响

糖尿病性视网膜病变（iii）是糖尿病的严重并发症之一。近年来，随着生活水平的提高，发病率和盲率呈上升趋势。然而,对于该病的治疗却没有一种理想的药物。DR的发病机制尚不明确,有研究表明核转录因子(nucleartranscriptionfactor,NF-κB)活化影响着该病的进程。通心络胶囊为中药复方制剂,主要成分为人参、全蝎、水蛭、蝉蜕、土鳖虫、赤芍、冰片等,已有研究将通心络胶囊用于DR的辅助治疗,但其相关机制尚不清楚。本实验采用自发性2型糖尿病KK/Upj-Ay小鼠模型,观察通心络胶囊低、中、高剂量对DR的治疗作用,并从NF-κB的激活角度探讨该药物可能的机制。1材料和方法1.1材料表面1.1.1小鼠体质量bbl/6g40只KK/Upj-Ay小鼠,体质量30~40g;10只C57BL/6小鼠,体质量25~30g;均为SPF级,雄性,12周龄,购自北京华阜康生物科技股份有限公司,生产许可证号:SCXK-(京)2009-0002。1.1.2isk引物pla通心络胶囊(购自石家庄以岭药业股份有限公司),IKKβ、IKBα、P-IKBα、NF-κB一抗(购自英国Abcam公司),7300荧光定量PCR仪(购自美国ABI公司),凝胶成像分析仪(购自美国Biorad公司)。IKKβ引物:上游:5’-CGTGACGGAGGAT-GAGAGT-3’,下游:5’-CGTTTGTCTTGCTGTCTGA-GA-3’,产物片段155bp;IKBα引物:上游:5’-GGT-GTTTGAATGTATTGCTGG-3’,下游:5’-AGGCT-GTTTGGCTGAGGT-3’,产物片段155bp;NF-κB引物:上游:5’-GCGAGAGAAGCACAGATACCA-3’,下游:5’-GGTCAGCCTCATAGTAGCCAT-3’,产物片段168bp;GAPDH引物:上游:5’-TGCTGAGTAT-GTCGTGGAGTC-3’,下游:5’-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3’,产物片段143bp(上海生工合成)。1.2方法1.2.1模型的配制及给药剂量及时间40只KK/Upj-Ay小鼠按血糖值随机分为模型组(Model)、通心络低(TXL-L,1g·kg-1)、中(TXL-M,2g·kg-1)、高(TXL-H,4g·kg-1)剂量组,C57BL/6小鼠为对照组(NC)。每组各10只,通心络高、中、低剂量组按对应剂量灌胃给药,对照组和模型组给予等体积的蒸馏水,均为每天1次,连续12周。4、8、12周后记录动物体质量。1.2.2测定空腹血糖值实验结束后,禁食12h,眼球取血,血糖仪测定各组小鼠空腹血糖(fastingbloodglucose,FBG)值。1.2.3eb含量测定给药结束后,每组随机取6只小鼠,尾静脉注射伊文思蓝(evansbluemethod,EB)溶液,按照文献方法,测定EB在视网膜的含量。1.2.4传统he染色冰上常规分离视网膜组织,将小鼠视网膜组织置于20倍体积的40g·L-1多聚甲醛溶液中固定,从低浓度到高浓度梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,连续切片,切片厚度0.4μm。依照以下顺序脱蜡至水:二甲苯2次、无水乙醇2次、每次10min;体积分数95%、90%、80%、70%乙醇,每次5min,蒸馏水5min;常规HE染色。光学显微镜下观察形态学变化。1.2.5dnapcr扩增分离小鼠眼球视网膜组织,Trizol法提取RNA,按照反转录试剂盒说明反转录为cDNA,-20℃保存。Real-TimePCR(qPCR)方法扩增,95℃预变性3min,95℃变性15s,58℃退火20s,72℃延伸30s,40个循环。以GAPDH作为内参照。最终结果计为与对照组进行比较后的相对值,对照组设置为1。1.2.6活性蓝透射镜取视网膜组织,加入组织裂解液,提取总蛋白或核蛋白。以β-actin作为内参照,SDS-聚丙烯凝胶电泳,待溴酚蓝距分离胶底部1cm时,停止电泳。依目的蛋白分子量分离条带,滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸依次放置于夹板内,4℃、100V电泳转膜1h。4℃封闭液振荡4h,滴加一抗,振荡混匀,4℃过夜。加入辣根过氧化物酶标记的二抗,室温孵育2h。化学发光法显色,对条带进行吸光度积分扫描。用目的蛋白吸光度值/内参照吸光度值的比值进行比较。1.3统计分析结果以ue0af±s表示,采用SPSS13.0软件进行ANOVA分析和LSD-t检验,P<0.05为差异具有统计学意义。2结果2.1体质量及fbg各时间点各组间比较差异均有统计学意义(均为P=0.00,见表1-表2),给药组、模型组体质量、FBG明显高于同期对照组(均为P<0.01),模型组与给药组差异无统计学意义(均为P>0.05)。2.2模型组与通心络组eb含量的比较与对照组比较,模型组EB含量明显升高(P<0.01),通心络组EB含量较模型组明显下降(均为P<0.05)。通心络中、高剂量组间无统计学差异(P>0.05),与低剂量组间均有统计学差异(均为P<0.05,见表3)。2.3视网膜色素上皮质HE染色显示对照组视网膜各层细胞层次分明,结构清晰;模型组视网膜色素上皮层明显变薄,细胞排列紊乱;通心络各剂量组细胞排列较清晰,剂量高组结构更致密,细胞排列更有序,上皮层细胞较模型组增厚明显(图1)。2.4各组大鼠nf-b蛋白表达水平的比较模型组IKKβ、IKBαmRNA和蛋白表达明显高于对照组(均为P<0.01),模型组核NF-κB和P-IKBα蛋白表达明显高于对照组(均为P<0.01);与模型组比较,通心络中、高剂量组IKKβmRNA和蛋白表达显著下降(均为P<0.01),各剂量组间有统计学差异(P<0.01);通心络组IKBαmRNA表达均显著低于模型组(均为P<0.01),低剂量组与中、高剂量组间均有统计学差异(均为P<0.01),中、高剂量组间无统计学差异(P>0.05);通心络中、高剂量组IKBα蛋白、P-IKBα蛋白的表达较模型组显著下降(均为P<0.01),通心络各剂量组之间有统计学差异(P<0.05);通心络组核NF-κB蛋白表达均低于模型组(均为P<0.05),各剂量组间有统计学差异(P<0.05);总NF-κBmRNA和蛋白表达在各组间无统计学差异(均为P>0.05,见表4)。3通心络胶囊对dr小鼠视网膜免疫组化的作用本研究采用了自发性2型糖尿病KK/Upj-Ay小鼠作为研究DR的模型,通心络胶囊灌胃12周,各剂量组不同程度地降低了视网膜内EB含量,改善其病理损伤,使视网膜各层较模型组排列整齐,从形态学上证实了通心络胶囊可延缓糖尿病小鼠DR的出现,对DR的防治有一定作用。通心络各剂量组与模型组相比,通心络组体质量和FBG无统计学差异(均为P>0.05),故考虑通心络胶囊不是通过降低体质量和血糖来改善DR的。各组间比较有统计学差异(均为P=0.00),说明不同剂量对视网膜的影响是不同的。目前,DR的发病机制仍不确切,越来越多的证据显示DR是一种炎性反应。NF-κB为重要的核转录因子之一,通常与IKB形成复合体,以无活性形式存在于细胞质中,可被多种因素激活,进入细胞核,与基因上的相应序列结合,调控炎性因子的表达,如TNF-α、白细胞介素(interleukin,IL)系列、急性期反应蛋白等。很多研究表明,NF-κB均积极参与糖尿病及其并发症的发生,故本研究围绕此展开。NF-κB信号通路中3个关键因子依次为IKKβ、IKBα和NF-κB。当高糖、缺氧、氧化应激、病毒、细菌等因素刺激细胞时,可激活IKKs,本实验也观察到模型组IKKβ较对照组有明显的上升趋势,IKKβ催化IKBα的N-末端丝氨酸磷酸化,实验中显示磷酸化的P-IKBα增加明显,导致IKBα泛素化并降解,则NF-κB游离,向细胞核内转移,核内的NF-κB增多,启动了炎症反应和下游通路。IKKs主要包括IKKα、IKKβ和IKKγ,p50/p65二聚体可被IKKβ活化,RelB/p52二聚体可被IKK-α活化,IKKα、IKKβ的活化可被IKKγ调节。NF-κB通常指P50/P65(ReLA)的二聚体。因此,本研究对NF-κB信号通路中的IKKβ、IKBα磷酸化和NF-κB的核表达环节进行了检测,显示模型组IKKβ、IKBαmRNA和蛋白,以及核NF-κB和P-IKBα蛋白表达均升高,给予不同剂量通心络胶囊治疗后,能不同程度降低以上因子的表达。提示通心络胶囊能通过抑制DR小鼠视网膜IKKβ、IKBα的磷酸化和核NF-κB的活化,干预IKKβ/IKBα/NF-κB信号通路,从而起到改善并防治DR的作用。NF-κB的活化可引起血管内皮生长因子(VEGF)、细胞间黏附因子(ICAM-1)等异常增多。目前,VEGF是最强的促进血管生长的因子,正常状态下,视网膜色素上皮细胞、Müller细胞少