单味代表药的通络作用研究

单味代表药的通络作用研究

心血管疾病严重危害人类健康，其诊断和治疗引起了现代药理工作者的关注。高同型半胱酸血症(HHcy)是心血管疾病的独立危险因素。近年来许多研究表明,HHcy能诱导血管内皮损伤和功能障碍,从而促进心血管病的发生和发展。而内皮功能障碍能加速、加重微循环障碍和微血栓形成。目前研究认为血管内皮功能障碍可能在冠脉痉挛的发病机制或潜在机制中扮演重要角色。络气郁滞是“络脉-血管系统病变学说”发生的始动因素;络脉瘀阻和络脉绌急是络病中主要的病理变化。近年来,根据“脉络-血管系统病变学说”理论研制出的治疗心脑血管病的代表方药通心络取得了良好的临床疗效。通心络全方由人参、土鳖虫、水蛭、全蝎、蜈蚣、蝉蜕、降香、冰片等药物组成,集中应用络虚通补药、虫类化瘀通络药、虫类搜风通络药和辛味通络药组方,具有益气活血、搜风通络的作用。本课题组研究已证实通心络对络脉瘀阻和络脉绌急有显著的防治效应。本实验通过建立内皮损伤、内皮损伤合并微血栓形成(络脉瘀阻)及内皮损伤合并急性心肌缺血(络脉绌急)大鼠模型,探讨具有通络作用的单味代表药的通络效果,并与复方通心络进行比较。1材料表面1.1实验动物雄性SPF级SD大鼠,体质量(150±20)g,由中山大学动物实验中心提供。1.2水从机械注射用针剂的配制通心络超微粉、人参、薤白、蜈蚣、水蛭均由河北以岭医药集团有限公司提供(通心络超微粉、人参、薤白、蜈蚣为粉状提取物,用纯水配成相应溶液,水蛭为腹腔注射用针剂;实验中以上药品所用剂量为预实验得到的最佳剂量)。L-蛋氨酸、琥珀酰磺胺噻唑(SST)、乙酰胆碱(Ach)、角叉菜胶、脂多糖(LPS)、精氨酸加压素(AVP)购于美国Sigma公司,NO测定试剂盒购于南京建成生物医学工程研究所,血管性假血友病因子(vWF)ELISA试剂盒购于上海太阳生物技术有限公司。2方法2.1大内伤模型2.1.1等离子体处理大鼠随机分为对照组、模型组、通心络组、人参组、薤白组、蜈蚣组及水蛭组。除对照组外各组动物均ig给予蛋氨酸1g/kg,SST0.5g/kg加入饮水,持续4周,对照组予以等量纯水处理。通心络组于ig蛋氨酸第4周开始ig给予通心络0.4g/kg,持续7d,人参组、薤白组、蜈蚣组于ig蛋氨酸第2周开始分别ig给予人参、薤白、蜈蚣1.2g/kg,持续3周,水蛭组于ig蛋氨酸第2周开始ip给予水蛭1.6U/kg,持续3周。2.1.2动脉环的制作(1)4周后各组大鼠以4%戊巴比妥钠ip麻醉后心脏采血0.5mL,与3.8%枸橼酸钠按9∶1混合均匀,4℃、3000r/min离心10min,取血清,分别采用硝酸还原酶法及酶联免疫吸附双抗体夹心法检测NO及vWF值。(2)实验结束后取大鼠主动脉,置于连续通含95%O2和5%CO2混合气体的改良Kerbs溶液(mmol/L:NaCl118、KCl4.7、CaCl22.6、MgSO4·7H2O1.2、KH2PO41.2、NaHCO325、葡萄糖5.5,pH7.4)中,小心分离周围脂肪和结缔组织,注意勿牵拉,保护内皮,将动脉条剪成3mm左右的环。动脉环置于37℃含4mLKerbs液的恒温浴槽中,一端固定于浴槽底部,另一端连接于张力换能器(JZ101)。浴槽中持续通含95%O2和5%CO2混合气体,并每隔20min换液1次,内槽恒温37℃,负荷1.5g,平衡1.5h。收缩张力信号通过MP—285Micromanipulatorsys(USA)的八通道接头传输到与Powerlab系统(ADinstruments,USA)相连的MacOSMacintosh计算机上,直接采用Powerlab系统及其软件ChartforWindows进行数据记录和分析。实验前预先给予100mmol/LKCl收缩血管,在随后的实验过程中,每一步实验完成后,及时冲洗,待曲线回至基线并稳定25min后再进行下一步实验。血管环高钾预收缩稳定冲洗至基线平衡后,4mLKrebs液定容,加入1×10-4mol/L苯肾上腺素40μL(终浓度为1×10-6mol/L),待收缩反应达平台后,①以不同累积浓度(1×10-10～1×10-6mol/L)的Ach作用于血管环,记录各浓度下血管环的舒张率,观察Ach诱导的内皮依赖性血管舒张反应;②以不同累积浓度(1×10-9～1×10-5mol/L)的硝普钠(SNP)作用于血管环记录各浓度下血管环的舒张率,观察SNP诱导的非内皮依赖性血管舒张反应。2.2大鼠颅内损伤和微血栓形成络脉血栓形成模型2.2.1内皮损伤模型的建立大鼠随机分为对照组、模型组、通心络组、人参组、薤白组及水蛭组。除对照组外,各组大鼠在内皮损伤模型制备(2.1.1项方法)基础上ip角叉菜胶10mg/kg,16h后ipLPS0.2mg/kg,对照组ip等量生理盐水。给药方法同2.1.1项。2.2.2纤血液流变学检测①注射LPS后20h,心脏采血1mL,与3.8%枸橼酸钠按9∶1混合均匀,以3000r/min、4℃离心15min,收集血浆,在2h内记录凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT),检测纤维蛋白原(FG)水平。另心脏采血0.5mL,使用1.8mg/mLEDTA抗凝管收集血液,4℃离心15min,收集血浆,2h内检测血小板计数(PLT)。以上均由中山大学附属第一医院检验医学部检测。②注射LPS后20～24h,观测大鼠肠系膜微循环:实验前将大鼠禁食12h,用4%戊巴比妥钠ip麻醉后固定,于腹腔一侧做3～4cm的切口,轻轻拉出肠系膜,置于37.0℃的恒温水浴槽内,选择适宜观察处并固定,置于三目显微镜下观察肠系膜微循环血流速度、动脉口径及流态,通过BI-2000医学图像分析系统录像。并采用微血管流态半定量法,根据血液流动状态,将流速分为7个等级,配合使用光点跟踪法,对微循环改变进行量化,计分越大,表示微循环障碍越明显。③注射LPS24h后采血,采用酶联免疫吸附双抗体夹心法测定血浆vWF值。2.3大鼠内战和急性心肌缺血络脉急性的模型2.3.1内皮损伤模型制备大鼠随机分为对照组、模型组、通心络组、人参组、薤白组、蜈蚣组及水蛭组。除对照组外,各组大鼠在内皮损伤模型制备(2.1.1项方法)基础上禁食18h后,ip4%戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉,颈静脉ivAVP0.1mL/100g。给药方法同2.1.1项。2.3.2t波低压试验①记录AVP注射后标准肢体Ⅱ导联心电图(30min),测量注射AVP后0、15、30s和1、2、3、4、5、10、20、30min时T波压低幅度。②记录心电图后采血,采用硝酸还原酶法测定血浆NO水平。2.4统计处理结果以ˉx±sx¯±s表示,应用SPSS11.0统计软件对资料进行One-WayANOVA统计分析。3结果3.1预防和处理内伤的内部损伤3.1.1各组大鼠血清中通心络组的比较人参组、薤白组、蜈蚣组及水蛭组血浆NO水平均显著高于模型组,其中通心络组升高更为明显;人参组、薤白组、蜈蚣组及水蛭组血浆vWF水平显著低于模型组,其中通心络组降低更为明显。见表1。3.1.2各组非内皮依赖性血管的张力在Ach诱导的内皮依赖性血管舒张反应中,人参组、薤白组、蜈蚣组和水蛭组最大舒张率较模型组均有所升高,其中通心络组升高更为明显。在SNP诱导的非内皮依赖性血管舒张反应中,各组间舒张率未见统计学差异。见图1和2。3.2预防和处理内伤和多脉血栓形成络脉血栓形成3.2.14个项目和plt的结果各用药组的FG水平与模型组比较显著升高;通心络组和水蛭组PLT显著高于模型组。见表2。3.2.2各组血浆vxf水平比较通心络组和水蛭组血浆vWF水平显著低于模型组(P<0.05)。对照组、模型组、通心络组、人参组、薤白组、水蛭组血浆vWF水平(n=8)分别为0.0514±0.0267、0.1750±0.0760、0.1013±0.0253、0.1131±0.0775、0.1254±0.0623、0.0814±0.0752。3.2.3血液流变性检查镜下可见模型组毛细血管甚至小血管阻塞,血管边缘模糊,血管周围弥漫性、片状渗血或大片瘀血,血液流变异常,颗粒感明显,呈粒缓流或粒摆流,红细胞呈中、重度聚集。各用药组肠系膜微循环血流速度明显加快,偶见瘀血,无渗血,基本无红细胞聚集现象。见表3。3.3治疗伤口损伤、急性心肌缺血络脉郁结的综合治疗3.3.1模型组t波低压幅度通心络组在注射AVP后30s～3min各时间点T波压低幅度与模型组相比均显著降低;蜈蚣组注射AVP后30s及2minT波压低幅度较模型组明显降低,见表4。3.3.2血浆no水平各用药组血浆NO值均显著高于内皮损伤合并急性心肌缺血组(P<0.05),其中通心络组升高更为明显。对照组、模型组、通心络组、人参组、薤白组、蜈蚣组、水蛭组血浆NO水平(n=8)分别为(33.53±9.819)、(9.127±5.449)、(27.78±7.048)、(25.38±6.997)、(17.31±5.038)、(18.05±2.863)、(26.42±6.76)μmol/L。4促进血管内皮损伤的作用根据络病学说,脉与络是以运行血液为主要功能的组织结构部分,脉络与中小血管及微循环概念有高度的一致性,在此基础上把传统中医络病理论与现代医学中小血管及微循环病变结合起来提出了“脉络—血管系统病变学说”。病理上络气郁滞引起的络脉自稳状态功能异常与血管内皮功能障碍具有内在一致性,均为“脉络-血管系统”病变的始动因素。络脉瘀阻和络脉绌急是络病中主要的病理变化。“络以通为用”是中医治疗络病的原则,益气通络(人参),辛温通络(薤白、降香),活血通络(水蛭)为主要通络治法。各通络药物有不同的通络特异性,人参补气容络,生津固脱;薤白辛温通阳,畅通络气;降香辛香通络,理气化瘀;水蛭化瘀通络,破血逐瘀。通络复方通心络是近年应用络病学说与通络药物治疗心血管病的代表性方药,各通络药物按君、臣、佐、使原则组合,益心气扶正以固本虚,使气旺血行、脉络畅通。血管内皮损伤或(和)功能障碍是血管病变始动及发展加重的首要因素,内皮功能障碍能加速、加重微循环障碍和微血栓形成。目前研究认为血管内皮功能障碍可能在冠脉痉挛的发病机制或潜在机制中扮演重要角色。内皮依赖性舒张反应的降低或消失是国际公认的评价血管内皮功能障碍的金标准,NO是血管内皮所合成分泌的最重要的血管活性物质。NO具有扩张血管、抗血小板黏附聚集、抗血管平滑肌细胞增生等作用,血浆NO水平可作为血管内皮损伤程度的评价标准。vWF可促进血小板的黏附与聚集,如血浆vWF水平也间接表明血管内皮损伤程度。本实验通过建立内皮损伤、内皮损伤合并微血栓形成(络脉瘀阻)及内皮损伤合并急性心肌缺血(络脉绌急)大鼠模型,探讨通络代表药的通络效果,并将其与复方通心络进行比较。实验结果显示通络代表药对饮食诱导的HHcy所致的内皮损伤有防治作用,可以改善内皮依赖性血管舒张功能,升高血浆NO水平,降低血浆vWF水平,起到保护血管内皮的作用,而通心络的作用更为明显;通络代表药干预内皮损伤合并微血栓形成模型,可以显著降低血浆