芽孢杆菌防治植物病害的研究进展

芽孢杆菌防治植物病害的研究进展

植物病害严重威胁了农业生产。施用化学药剂一直是人类防治植物病害的主要策略,具有见效快、杀菌谱广、成本低等优点。然而,长期大量施用化学农药导致农药残留及环境污染,最终危害人类健康并破坏生态平衡,同时也使病原菌对各种化学杀菌剂产生了严重的抗药性。生物防治因其对环境、生态及人类健康安全、无毒等优点得到了世界各国的广泛重视并发挥着越来越重要的作用。利用多种有益微生物及其代谢产物已成功应用于植物病害的生物防治中。这些微生物包括真菌、细菌、放线菌等多个生物种群。其中芽孢杆菌属的细菌具有生长速度快、营养需求简单、有较强的耐热性及抗逆性、在植物表面易于存活与繁殖、对人畜无害、不污染环境、制剂稳定、施用方便等优点,不仅符合人们对绿色食品的需求,而且为农业的可持续发展提供了保障。因此,芽孢杆菌作为一种较为理想的生防微生物,逐渐成为近年来研究的热点。鉴此,笔者综述了几种主要芽孢杆菌防治植物病害的研究进展和应用现状、芽孢杆菌防治植物病害的主要作用机制、生防芽孢杆菌的遗传改良研究进展,并对芽孢杆菌及其制剂在生物防治领域的发展前景进行了展望,旨在为芽孢杆菌在防治植物病害中的进一步开发与应用提供参考。1殖与繁殖繁殖芽孢杆菌易从土壤和植株中分离得到,能产生耐热、抗逆性的芽孢,具有显著的生防潜力,利于生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中存活、定殖与繁殖。目前,用于防治植物病害的芽孢杆菌主要有枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、侧孢芽孢杆菌(B.laterosporus)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)等。1.1枯草芽孢杆菌的使用枯草芽孢杆菌是迄今为止研究最深入的一种芽孢杆菌,目前利用枯草芽孢杆菌防治植物病害成为生物防治植物病害研究的热点,国内外已有较多报道。现报道的从作物的根际土壤、根表、植株及叶片上分离筛选出的枯草芽孢杆菌菌株对不同植物的真菌和细菌病害具有防治作用,如粮食作物中的水稻纹枯病、稻瘟病、小麦纹枯病、豆类根腐病、水稻穗颈瘟、小麦全蚀病等,蔬菜病害中的番茄叶霉病、黄瓜枯萎病、黄瓜霜霉病、茄子灰霉病、茄子白粉病、辣椒疫病、番茄纹枯病等。枯草芽孢杆菌还可控制采后水果的多种疫病,如苹果霉心病、油桃褐腐病、柑橘青霉病、草莓灰霉病、草莓白粉病、香蕉枯萎病、香蕉冠腐病、香蕉炭疽病、苹果梨青霉病、苹果梨黑斑病、苹果梨溃疡病和金花梨果腐病。此外,枯草芽孢杆菌对杨树溃疡病、腐烂病、黑斑病及炭疽病、茶轮斑病、烟草炭疽病、黑胫病、根腐病以及棉花立枯病等也有较好的防治作用。生防枯草芽孢杆菌B29菌株对引起大豆根腐病的镰刀菌、腐霉菌和立枯丝核菌具有强拮抗作用,田间防效达56.3%~89.1%,同时,该生防菌株还可刺激植株的增产,增产率为9.4%~24.6%。Daivasikamani等使用枯草芽孢杆菌来防治咖啡锈病的病原菌咖啡锈菌(Hemileiavastatrix),体外抑制试验结果表明枯草芽孢杆菌试验剂量为1×108cfu/ml时对Hemileiavastatrix孢子萌发的抑制率高达68.20%,而在体内试验中枯草芽孢杆菌在相同剂量下对Hemileiavastatrix孢子萌发的抑制率也能达到42.98%。国外对枯草芽孢杆菌的研究较多,且一些枯草芽孢杆菌菌株已作为商品生产和出售。美国现有4株枯草芽孢杆菌生防菌株,分别是QST713、GBO3、MBI600和FZB24,已得到美国环保署(EPA)商品化或有限商品化生产应用许可。QST713粉剂配以一定量水喷洒在叶面,可抑制枯萎病、痂病、灰霉病和几种霉菌病害的病原真菌菌丝体和植物疾病。GBO3菌株可产生抗真菌化合物,分泌的挥发性物质可直接促进植物生长。该菌株可直接施于土壤,主要抑制由丝核菌(Rhizoctonia)、镰刀菌(Fusarium)、曲霉(Aspergillus)等引起的植物根部病害。美国Gustafson公司和MicrobioLtd公司将能够分解淀粉的枯草芽孢杆菌和MBI600菌株制成混合生防药剂,称为BioYieldTM。FZB24菌株在液体培养液中可产生伊枯草菌素等脂肽类抗生素,可防治镰刀菌、丝核菌引起的根腐病和枯萎病。此外,1990年由日本AHCLtd公司分离得到的DB9011菌株安全性好、无毒害,得到东京食品安全协会的认可,并在美国和欧洲等7个国家得到专利认证。在我国,利用枯草芽孢杆菌防治植物病害也取得较大进展,现已开发成功并投入生产的商品制剂有亚宝、百抗、麦丰宁、纹曲宁等。此外,江苏农业科学院植物保护研究所开发的B.subtilisB916也已进行农药登记,对水稻纹枯病的田间防效连续10年在50%~80%。1.2对抗菌性能的影响侧孢芽孢杆菌(Brevibaeilluslaterosporus)具有多种生物学活性,如抗菌活性、抗肿瘤活性、杀虫活性等。早期的研究主要集中在杀虫活性方面,而近年来侧孢芽孢杆菌产生的抗菌活性物质对植物病害生物防治的研究越来越受到研究者的关注。侧孢芽孢杆菌X10固体菌剂的田间应用效果试验表明,固体菌剂对番茄青枯病有很好的防治效果,同时还能够促进番茄植株的生长和增加产量。Zhao等在种植芒果的土壤中分离到的侧孢短芽孢杆菌A60的代谢产物对辣椒疮痂病菌(Xanthomonasvesicatoria)、黄瓜棒孢叶斑病菌(Corynesporacassicola)和番茄早疫病菌(Alternariasolani)等多种植物病原菌都有抑菌活性。此外,杜春梅等开展了对侧孢芽孢杆菌BL-21的研究,发现该菌发酵液对黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、甜瓜枯萎病菌(F.oxysporum)、水稻恶苗病菌(F.moniliforme)、小麦赤霉病菌(F.graminearum)等多种植物病原真菌具有抗菌活性。通过Sephadex层析和CM-SepharoseFastFlow离子交换层析从发酵液中分离得到4种抗菌物质,初步推测可能为蛋白类或抗菌肽,或者是含有肽键结构的抗菌物质。1.3病原菌对耐药菌的影响蜡样芽孢杆菌对多种植物病害有较明显的抑制作用。研究表明,将香蕉苗根系经蜡样芽孢杆菌和病原菌分别处理后,根系中与抗病性调控相关的酶的活性明显提高。蜡样芽孢杆菌BC98-Ⅰ发酵液与其抑菌粗提物对黄瓜枯萎病菌具有良好的抑制作用,使孢子萌发率降低、菌丝生长异常,且抑菌特性稳定,对外界环境有很强的耐受性和适应性。1.4地衣芽孢杆菌防治地衣芽孢杆菌产生的多种抗菌物质对一些植物病原菌,尤其是病原真菌有较好的抑制作用。地衣芽孢杆菌可用于防治番茄灰霉病、棉花枯萎病、黄萎病、水稻稻瘟病、辣椒病害,也可用于防治采后水果病害。地衣芽孢杆菌W10的发酵液和除菌发酵液都可诱导番茄植株对灰霉病的系统抗性,持续时间达12d以上。1.5真菌代谢产物前人对苏云金芽孢杆菌(Bt)的研究主要集中在杀虫特性方面,然而近年来Bt在植物真菌病害防治方面的研究也逐渐增多,现已发现其产生的代谢产物如几丁质酶、脂肽类抗生素等对植物的真菌病害有较好的抑制作用。William等诱变BtHD-548后筛出一株高产几丁质酶、广谱抑真菌的突变菌株,并于2001年申报了菌株及基因专利。Driss等也发现产几丁质酶Btkurstaki菌株的发酵上清液对黑曲霉有很强的抑制作用。1.6山鱼植物的生长多粘类芽孢杆菌对人或动植物没有致病性,某些菌株可产生如抗生素、拮抗蛋白、植物激素、酶、絮凝剂等多种生物活性物质,也是一类重要的植物生防细菌和植物根际促生菌(Plantgrowth-promotingrhizobacteria,PGPR),并在植物病害防治以及人和动物疾病治疗方面具有很好的应用前景。Choong-Min等报道,多粘类芽孢杆菌E681可抑制猝倒病等多种芝麻土传病害,促进芝麻生长。其抑菌谱广,对终极腐霉菌(Pythiumultimum)、德巴利腐霉(Pythiumdebaryanum)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)、番茄叶霉病菌(Cladosporiumfulvum)等也有明显的抑制作用。1.7对抗菌性能的影响在防治植物病害中除上述芽孢杆菌种类外,其他种类抗菌能力强的芽孢杆菌也逐渐被发现、筛选和研究。Swadling等报道,短小芽孢杆菌NCIMB13374能抑制草莓灰霉病菌的生长。另外,短小芽孢杆菌D82对小麦根腐病有强抗生作用。短小芽孢杆菌和乳芽孢杆菌(Lactobacillussp.)都有防治豆类和番茄灰霉病的作用,能降低灰葡萄孢分生孢子的萌发和片腐烂的严重程度。近年来,有报道海洋芽孢杆菌(B.marinus)、坚强芽孢杆菌(B.firmus)、萎缩芽孢杆菌(B.velezensis)、莫哈韦氏芽孢杆菌(Bacillusmojavensis)以及一些新筛选的未定种的芽孢杆菌都具有拮抗植物病原菌的作用。2芽孢杆菌的作用机制近年来,国内外研究者在芽孢杆菌对植物病菌的作用机制方面进行了大量研究,认为不同的芽孢杆菌其作用机制和方式是多样的,主要包括拮抗作用、竞争作用和诱导植物抗性等几个方面。2.1抗菌活性物质拮抗作用主要指2种或2种以上的微生物共同生长时,一种微生物在同化作用中产生1种或几种特异次生代谢产物(如抗生素、抗菌蛋白等抗菌物质),改变其微环境,从而抑制甚至杀死另一种微生物的现象。拮抗作用是生防芽孢杆菌最主要的作用,也是研究较为深入广泛的一种抗病机理,常作为生防菌初步筛选的重要指标。芽孢杆菌产生的抗菌活性物质主要有细胞壁降解酶类(如几丁质酶和葡聚糖酶)、细菌素类、抗生素类(包括脂肽类抗生素和多肽类抗生素)等抗菌物质。BacillussubtilisTG-26产生的抗真菌小肽LP-1对瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)、玉蜀黍赤霉病菌(Gibberellazeae)、长柄链格孢(Alternarialongipes)和水稻稻梨孢(Pyriculoriaoryzae)等有很强的抑制作用。另外,有些菌株还能产生聚酮类、酚类、大环内酯类和多烯类抗菌物质以及挥发性抗菌物质。海洋枯草芽孢杆菌Bs-1可产生一种有抗真菌活性的化合物,该化合物含有共轭双键但无氨基酸残基,这与芽孢杆菌抗生素的结构不同,很可能是一种新的非肽类化合物。还有些抗菌物质主要通过溶解细胞壁或细胞膜造成原生质泄漏,使菌丝断裂或畸形,同时抑制病原菌孢子的萌发。有些抗菌物质如表面活性素能在植物根部形成一层生物膜,保护植物根部免受病原菌的入侵。结构不同的抗菌物质其抑菌机理也不同,某些菌株能同时分泌多种结构相似的抗菌物质,这些抗菌物质还表现出协同增效的作用。2.2铁载体对植物病原菌真菌的作用芽孢杆菌的竞争作用主要包括空间位点竞争和营养竞争。以空间位点竞争占优势,即在植物根际、体表、体内及土壤中快速、大量繁衍和定殖,有效地排斥、阻止和干扰植物病原微生物在植物上的定殖与侵染,达到抑菌控病的效果。营养竞争包括对土壤中磷、氮和铁等元素的竞争。能否利用到营养决定了某种微生物在其小生境中是否为优势菌群。铁载体对铁的竞争是很多细菌生防菌剂抑制植物病原真菌的重要特征。Yu等对枯草芽孢杆菌CAS15进行研究时发现,CAS15菌株产生的铁载体与铁结合具有高特异性和亲和力,在低铁环境下与病原微生物竞争铁离子,从而限制病原菌的生长。CAS15不仅对辣椒枯萎病有很好的生防效果,还可促进植株生长。枯草芽孢杆菌B47菌株能通过番茄根、茎和叶的伤口进入植株体内,入侵后主要定殖在番茄维管束的导管中,再接种番茄青枯病菌,对番茄青枯病的防治效果达81.25%。郭荣君等利用营养竞争平板筛选法,将芽孢杆菌与植物病原真菌在大豆麦麸培养基上共培养,枯草芽孢杆菌菌株B010和B006快速利用培养基中的营养物质,在培养基上迅速生长蔓延,可完全抑制尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)和茄病镰刀菌(Fusariumsolani)菌丝生长,对真叶期大豆根腐病的防治效果分别为63.5%和74.6%,同时大豆产量分别增加24.0%和13.8%。2.3水稻叶生物酶系统sar诱导植物抗性是生防芽孢杆菌发挥生防作用的一个重要方面。芽孢杆菌可作为植物激活剂,诱导植物系统获得抗性(Inducedsystemicresistance,ISR),与病原物诱导的植物获得性抗性(Systemicacquiredresistance,SAR)具有相同的表型特征。作用机制主要是通过组织木质化增强细胞机械屏障和产生植保素,该过程涉及POD、PPO、PAL与SOD的活性变化。它们共同作用可抵抗真菌、细菌和病毒,保护植物免受病原菌的危害,降低损失,显著减少病害程度,并能促进作物生长。Tang发现B.subtilisB3菌株能诱导小麦POD活性增强,并产生一些新的POD。水稻纹枯病生防菌B916能诱导水稻叶鞘细胞PAL、POD、PPO和SOD活性增强,且分别在24、48、72和24h内达到最高。Romeiro等对分离到的BacilluscereusUFV-101研究时发现,该菌株的发酵上清液能诱导番茄叶片对丁香假单胞杆菌番茄致病变种(Pseudomonassyringaepv.tomato)产生抗性,以减轻植物病害。3蘑菇的遗传改良生防芽孢杆菌的遗传改良的主要目的是增强其抗菌活性、扩大抑菌谱、增强其在植物寄主上的定殖能力,从而提高防病能力。3.1ilis14菌的鉴定韩文霞等将6.5kbDNA的几丁质酶基因转入芽孢杆菌D2中获得了工程菌株D2-chib。构造好的工程菌株对番茄灰霉病的抑制率显著好于原始菌株,粗酶液酶活为4.06U/ml,是原始菌株酶活的33.8倍,显著提高了菌株对番茄灰霉病的生防效果,在番茄温室大棚防效试验中防效显著,100倍的发酵稀释液对番茄灰霉病的抑病率达到91.34%。Coutte等将功能基因sfp重组入B.subtilis168菌中,使重组型启动子PrepU取代菌株中的原始启动子srfA,经液体培养基培养6h后发酵液中分泌的表面活性素含量是原始菌株的6倍,显著提高了对植物病原真菌的抑菌活性。aiiA基因是报道的第1个群体感应淬灭酶基因,是从芽孢杆菌240B1中克隆到的酰基高丝氨酸内酯酶基因(aiiA),编码一个AHL内酯水解酶。编码AHLs降解酶的基因可能广泛存在于多种原核生物中。该基因所表达的蛋白是一种具有降解AHL分子作用的特异性内酯水解(AHL-Lactonase,简称AiiA蛋白)蛋白。该类蛋白通过水解信号分子AHLs[AI-1型信号分子即N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserinelactones,AHL或acyl-HSL)]的内酯键,降低致病菌群中AHL分子的浓度,从而减弱致病菌的致病性。朱晨光等通过重叠延伸PCR技术,采用将aiiA基因自身的启动子换成杀虫晶体蛋白基因cry3Aa的启动子,构建出融合基因pro3A-aiiA。将融合基因装入穿梭载体pHT304的BamHI/SphI位点,得到了重组质粒pBMB686并转化Bt无晶体突变株BMBl71,重组菌株BMB686的表达AiiA蛋白的能力大大增加,对信号分子AHLs的降解能力和对胡萝卜软腐欧文氏菌感染马铃薯产生软腐病害的抑制能力也明显加强。3.2抗病毒种的融合子将杀虫基因导入生防菌株可望降低防治成本、扩大防治对象,我国率先在该方面进行了研究。Tang等将杀虫基因导入B.subtilisB908,将B.thuringiensis7216与B.subtilisB908原生质体融合构建了具有防病增产和杀虫作用双功能的融合子CF103。田间试验结果表明,CF103能兼防水稻纹枯病和稻纵卷叶螟,对照区病情指数为49.8%,虫害率为41.5%,而防治区相应为0~36.