少孢根霉gim31921发酵全程防腐剂的工艺研究

少孢根霉gim31921发酵全程防腐剂的工艺研究

腐烂是一种具有中国特色的食品。在其发酵过程中,前酵为培菌过程,即菌种分泌蛋白酶、脂肪酶等酶系,以利于后酵各酶系的协同作用。腐乳发酵全过程的一个显著特征就是产生以蛋白酶为主的酶系,使其具有质地细腻、风味独特、营养丰富、易消化吸收等特点。然而不同发酵菌种制得的腐乳质地、风味和营养等各不相同。以少孢根霉为菌种发酵大豆而成的食品谓之丹贝,因其营养丰富,蛋白利用率高深受东南亚等国人民的青睐。尤其是该菌发酵的豆制品,使其中的异黄酮大量转化为具有多种抗病、保健功效的生物活性成分———活性异黄酮,而且符合现代人们养生保健的理念。刘欣等报道少孢根霉、雅致放射毛霉和五通桥毛霉三菌种发酵腐乳异黄酮的含量,以少孢根霉聚首,说明该菌种发酵制得的腐乳营养品位上成;孙兴民等对少孢根霉RT-3株发酵腐乳的前酵工艺、蛋白酶活力和氨基酸态氮的含量测定等进行了报道;本研究则以少孢根霉GIM3.381为菌种发酵腐乳,并以蛋白酶活力为该菌发酵代谢各指标的表征指标,对其发酵工艺的前酵给予探索、优化;对发酵全程的质构特性、成熟期的主要参数亦予检测。此为开发该菌发酵、且兼备营养保健双重功效的豆类制品奠定研究基础。1材料和方法1.1仪器、试剂与仪器少孢根霉GIM3.381购于广东省微生物研究所菌种保藏中心;新鲜北大荒老豆腐、黄酒、食盐、红曲米、面糕曲、马铃薯及糖精市售;葡萄糖、氯化钠、干酪素、氢氧化钠、三氯乙酸、乳酸、碳酸钠、硝酸银、铬酸钾、甲醛、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、福林酚试剂、琼脂天津市科密欧化学试剂有限公司,分析纯。TE124S型电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司;HWS24型电热恒温水浴锅、GRX-9073A型空气消毒箱、DHP-9162型电热恒温培养箱上海一恒科技有限公司;PB-10型pH计北京赛多利斯仪器系统有限公司;低速自动平衡离心机北京医用离心机厂;TGL-16G型台式离心机上海安享科学仪器厂;722型可见分光光度计上海元析仪器有限公司;气动恒温摇床上海智诚分析仪器制造有限公司;TA-XTplus型质构分析仪英国StableMicroSystems公司;BCD-256DT型冰箱青岛海尔有限公司。1.2实验方法1.2.1准备前处理1.2.1.1.药品悬浮液少孢根霉在PDA平板上37℃培养3d;无菌水制成107cfu/mL的孢子悬浮液,用于接种。1.2.1.2毛纺1.2.2单因素前氧化实验1.2.2.1.氧化ph的确定白坯分别以pH1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0和4.5的乳酸酸化,以8%的孢子悬液接种,30℃培养60h。1.2.2.2.收养率的确定以上确定的pH,分别以6%、8%、10%、12%和14%的孢子悬液接种,30℃培养60h。1.2.2.3c温度的确定1.2.2.4时间的确定以上各实验条件均采用福林酚法测定蛋白酶活力为表证指标,并有3次重复。1.2.3最佳工艺条件的确定在单因素实验的基础上,根据正交实验中心组合实验设计原理,进行L9(34)正交实验设计,实验条件见表1,以蛋白酶活力为表征指标,3次重复,确定前酵最佳工艺条件。1.2.4盐膏的制备1.2.5发酵准备1.2.5.染坯红曲卤的制备配料a:将1.5kg红曲和0.6kg面糕曲用6.5kg黄酒浸泡2~3d,磨浆,加18kg黄酒搅匀,得染坯红曲卤。配料b:3kg红曲和1.2kg面糕曲用12.5kg黄酒浸泡2~3d,磨浆,加63kg黄酒和15g糖精搅匀,得装坛红曲卤。1.2.5.2安装1.2.6全过程的质量结构和成熟阶段的主要指标的测定质构:TPA下压法;水分:恒重法;氯化钠含量:硝酸银滴定法;氨基酸态氮含量:甲醛滴定法。以上各实验3次重复。2结果与分析2.1单因素前氧化实验2.1.1初始ph对产品发酵的影响由图1可知,随酸化pH的升高,表征指标先升后降。pH1.5~2.5时,攀升急剧,达最大值;而pH2.5到4.5时,逐渐下降。可见pH的高、低均影响菌种代谢及发酵腐乳的品质。从表观酸化pH指标看,2.5时效果最佳,蛋白酶活力达23.69μg/mL。但此时腐乳白坯的实际pH应是大于2.5的,这一点与孙兴民等报道少孢根霉最适pH为3.0~4.5相符。所以该菌在此最适pH时生长最旺,发酵效果最佳,同时,也说明该菌在有杂菌的发酵条件下具有竞争优势,因而适于生产实际。故确定前酵pH2.5。2.1.2接种量指标降低由图2可知,不同接种量时,表征指标为先升后降。接种量6%至10%时,指标逐渐升高,在10%时达最高值21.22μg/mL;接种量10%~14%时,指标逐渐走低。6%~10%的接种量,指标升高,是因为生物群体只有在一定的数量水平时代谢活力旺盛,才能表现出更适应环境的能力,符合微生物典型生长曲线理论中的接种量要求达到“一定量”的概念;而接种量10%~14%时,指标不升反降,原因应是同种菌种间营养竞争所致。所以在实际生产中,不同接种量同样能达到最佳效果时应遵循接种量少的原则,故确定接种量为10%。2.1.3反应温度对发酵的影响各温度的表征指标图3所示。由本室以往研究及相关报道可知,少孢根霉属于温性真菌,最适温度37℃,但本实验数据却以20℃为佳。分析认为:在温度较高或最适温度时,菌株代谢快、代时短,菌种易老化。相反,生产实践中的一些酶促反应温度往往在亚适温度下、酶促反应速率较缓时表现出最佳的发酵效果,即获得性状良好的产品。同时本实验也再一次认证了:在发酵实践中,微生物最适生长温度不一定是其产生代谢产物的最适温度的理念。为此,所试菌株发酵腐乳的前酵温度为20℃。2.1.4发酵时间的影响在优化了pH、接种量、温度三个条件后又对该菌的前酵时间进行探测,结果由图4可知,表征指标先升后降。12~36h指标缓慢上升,36~48h升高明显,说明发酵菌群体代谢活跃,是发酵的鼎盛时期;48h时,最大值为22.06μg/mL。从外观形状上看,48h的菌丝洁白致密,性状良好。然而,时间在48~60h,不但表征指标下降,毛坯表面也出现黑色孢子,性状不佳,并伴有不良气味,对此认为是酶系作用时间过长、分解过盛、坯体腐败变质所致。因此确定前酵时间48h。2.2蛋白酶活力用L9(34)正交表安排实验,实验结果见表2,方差分析见表3。根据表2极差R的大小得出:4个因素对蛋白酶活力影响为D>B>A>C,即接种量>时间>温度>pH,由表3看出,因素接种量对蛋白酶活力影响显著(p<0.05),由表2可知,因素pH对蛋白酶活力影响较小,故表3中未列出。理论最佳发酵条件A1B2C2D2,即发酵温度20℃,时间48h,pH2.5,接种量10%,蛋白酶活力为22.06μg/mL。2.3发酵过程中的主要物质结构和成熟指标的测定2.3.1后酵阶段3g60d由图5可知,腐乳发酵过程中,硬度先增后减。前酵阶段,少孢根霉形成的菌丝将毛坯紧密包裹,硬度由白坯1199.9g升高至1203.6g;盐制阶段,食盐进入坯体,部分水分被析出,硬度增加显著,盐坯第7d时,硬度达到最大值为2535.5g;后酵阶段中前40d,腐乳硬度迅速减小,40~60d变化不明显,并在50d时变化趋于稳定。后酵前40d的一段时间汤料不断向坯体浸透,硬度迅速减小;到40d后坯体与汤料的盐度接近,汤料向坯体渗透减少,故硬度变化不明显,50d时硬度较白坯下降75.5%。2.3.2盐制阶段小体积弹性下降由图6可知,发酵过程中,弹性逐渐减小。前酵阶段,少孢根霉菌丝将毛坯紧密包裹,使坯体结构致密,故弹性变化幅度较小,仅由白坯时0.89降至0.86;盐制阶段,弹性减小但不明显,主要由于食盐的加入使坯体硬度增加,导致弹性略降;后酵阶段前40d,由于酶系的作用使大分子物质逐渐降解为小分子,坯体逐渐疏松,弹性逐渐减小,40~60d时,酶系作用基本完全,故弹性变化不明显,并在50d时趋于稳定,此时弹性较白坯下降42.2%。2.3.3后酵50d的质构特性及乳酸成熟标准由图7可知,发酵过程中,黏着性逐渐升高。前酵阶段,少孢根霉分泌的酶系将部分大分子物质分解成小分子,黏着性缓慢上升,由白坯的161.7J升高到165.2J;盐制至后酵阶段,酶系作用持续进行,腐乳中蛋白质逐渐至完全发生降解,黏着性持续上升,至后酵50d时黏着性较白坯升高42.5%。腐乳在后酵50d时质构变化趋于稳定,酒精味道消失,质地细腻,推测腐乳已成熟,此时测其氨基酸态氮、水分和氯化钠含量分别为1.76g/100g、66.1%和8.9g/100g。据余若黔等报道氨基酸态氮含量≥1.5%时腐乳即成熟,并且根据国标:成熟的红方腐乳水分含量≤72%,氯化钠含量≥6.5g/100g,由以上可知,后酵50d达腐乳成熟标准。腐乳发酵过程中:一方面以蛋白酶活力为表征指标优化出前酵最佳工艺,在后酵过程中以蛋白酶为主的酶系分解坯体中的蛋白质、脂肪等化学物质,从而使白坯向腐乳的转变得以完成;另一方面从硬度、弹性较大的白坯到质地细腻、入口无渣的腐乳,体现出发酵过程是理化性质的变化引起质构的变化,而理化性质的变化是以蛋白酶为主的酶系所决定的,可见整个实验中各指标间的变化相互影响、关系密切。3测定方法3.1少孢根霉GIM3.381发酵腐乳前酵最佳工艺:温度20℃,时间48h,pH2.5,接种量10%,蛋白酶活力为22.10μg/mL。3.2腐乳发酵过程中,坯体的质构变化为:硬度先增后减、弹性逐渐降低、黏着性逐渐升高。3.3腐乳后酵50d成熟,此时硬度较白坯下降75.5%、弹性下降42.2%、黏着性升高42.5%;同时水分