高脂饲料诱发高脂血症大鼠肠道菌群结构变化

高脂饲料诱发高脂血症大鼠肠道菌群结构变化

高脂饮食是高血压的主要原因。高脂血症(hyperlipidemia)是中老年人常见疾病之一,也是倍受关注和严重影响中老年人正常生活的疾病。近十几年来,随着生活方式西方化、饮食习惯的改变以及日常运动量的减少,高脂血症的发病率有明显的升高趋势,而高脂血症又会并发动脉硬化、心脑血管疾病、冠心病、高血压病、心肌梗塞、脑中风等致死率致残率很高的各种严重疾病,这已经严重影响到了人类的健康和生活质量。目前,高脂血症发生发展机制的研究是医学领域的重要课题。尽管许多研究表明,某些类型的高脂血症是由于单基因缺陷或多基因缺陷,使参与脂蛋白转运和代谢的受体、酶或载脂蛋白异常所致,但由于在短期内人类的基因型不可能发生重大的改变,所以高脂血症研究者们已经将注意力集中到作为人类后天获得的“第二基因组”,已有的研究表明,由于肠道菌群的存在能提高宿主从食物中摄取能量的效率、调控脂肪代谢以及引起低水平的慢性炎症反应,从而导致高脂血症的发生。因此,探索肠道微生物与高脂血症之间的关系日益成为国际学术界关注的焦点。肠道微生物的数量占机体微生物总量的78.67%,是机体微生态系统最重要的组成部分。肠道菌群参与了宿主的代谢、免疫、生理、生化、药理等多方面的过程。LEY等报道,遗传性肥胖小鼠的胃肠道细菌群落含有更多的厚壁菌门细菌,而它们瘦弱的同伴有更多的拟杆菌门细菌。HIDENORI等的实验也证明,肠道菌群主要包括拟杆菌门和硬壁菌门,总数达到98%以上,而在硬壁菌门中有95%属于梭菌纲(Clostridia),从种的水平上来看,双歧杆菌、肠杆菌、乳杆菌各占1%左右。微生态学者发现肠道菌群中的双歧杆菌、乳酸杆菌、拟杆菌、梭菌属等与胆固醇代谢有直接关系,TANG和DENIPOTE的研究也证明肠道中存在的双歧杆菌和以嗜酸乳杆菌为代表的乳杆菌等益生菌具有调节血脂的作用。近些年来,越来越多的科研工作者通过肠道菌群的变化来研究高脂血症,但到现在为止,有关高脂血症与菌群的关系研究还是不能确定到底哪些细菌和高脂血症直接相关。考虑到实验动物品系、性别及饲喂高脂饮食的时间都会对高脂血症造成影响,本研究通过建立与人类肥胖最为接近的营养性动物肥胖模型,依靠分子生物学方法进一步研究高脂血症大鼠肠道的主要菌群数量变化和分布模式,以确定可能对脂类吸收和高脂血症形成具有一定影响的主要肠道菌群,为阐明高脂血症的形成和对高脂血症的干预提供一条新的思路和途径,从而为外源性嗜酸乳杆菌,双歧杆菌,植物乳杆菌等益生菌在调节人体血脂方面的进一步应用奠定基础。1材料和方法1.1材料表面1.1.1基础饲料及高脂饲料清洁级SD(SpragueDawley,SD)雄性大鼠24只,体重120～150g(购于北京维通利华实验动物技术有限公司);基础饲料:面粉20%、米粉10%、玉米20%、麸皮25%、豆料20%、骨粉2%、鱼粉2%、食盐0.9%、维生素0.1%;高脂饲料:猪油8%、胆固醇1%、牛磺胆酸钠0.25%、维生素1%、基础饲料89.75%。基础饲料和高脂饲料配方均由内蒙古大学实验动物中心提供,其中胆固醇及牛胆酸钠(BR级)购自北京双旋生物工程有限公司,猪油为市售。1.1.2荧光定量等试剂血总胆固醇(TC)定量测定试剂盒、甘油三脂(TG)定量测定试剂盒均购自中生北控生物科技股份有限公司。TaqDNA聚合酶、DNAMarker,荧光定量等试剂均购于北京全式金生物技术有限公司,本实验所用引物序列见表1所示,均由上海桑尼生物科技有限公司合成。ND-1000型微量紫外分光光度计、DYY-12型电泳仪、CDS8000型UPV凝胶成像分析系统、Appliedbiosystem公司的PCR仪,伯乐公司变性梯度凝胶电泳仪(BIORAD的DCodeUniversalMutationDetectionSystem)等。1.2方法1.2.1模型组bnSD雄性大鼠24只,随机分为A、B两组,正常组A(n=12),模型组B(n=12)。分组后常规喂养观察1周,无异常后开始实验,A组大鼠以基础饲料饲喂,B组大鼠以高脂饲料饲喂,每鼠每天25g,连续42d(不计观察期)。1.2.2血液样本的采集和分析分别于0、18和42d对大鼠称重,并对大鼠进行股动脉采血,按照试剂盒说明书进行血TC、TG的测定。1.2.3大鼠肠道菌体的制备分别于0、9、18、30和42d取各组大鼠新鲜成型粪便,将采自同一大鼠个体的1g粪便溶于15mL的PBS缓冲液中,充分搅拌、振荡并摇匀,300r/min离心5min,收集上清液,然后再将上清液9000r/min离心10min,弃上清,收集沉淀,便得到菌体。1.2.4基因组dna的检测采用改良的CTAB-液氮反复冻融方法提取粪便基因组DNA,使用ND-1000型微量紫外分光光度计检测基因组DNA的浓度以及A260/A280,再用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。1.2.5pcr程序以上述基因组DNA为模板(将DNA原液稀释到100ng/μL),选用引物V3F+GC和V3R+GC对粪便总基因组16SrRNA的V3可变区进行扩增,反应在50μL体系中进行,包括10×PCRbuffer5μL,dNTPMIX(2.5mmol/Leach)4μL,模板(100ng/μL)1.5μL,上、下游引物各2μL,TaKaRaTaq聚合酶(5U/μL)0.5μL,加无菌去离子水至50μL。所采用的降落式PCR程序为:95℃预变性4min;95℃变性45s,65℃退火1min,72℃延伸2min,之后每一个循环退火温度就下降0.5℃,共循环20次;95℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸2min,10个循环;72℃终端延伸7min,4℃终止。1.2.6%100%的变性剂将300ng扩增产物于8%的聚丙烯酰胺凝胶上进行分离,变性剂线性梯度范围为27%～52%(100%的变性剂包含7mol/L尿素和40%去离子甲酰胺)。电泳在恒温60℃,1.0×TAE缓冲液中进行,恒压20V,10min预跑,200V电压电泳4.5h时,终止电泳。电泳结束后进行银染,并对电泳PCR-DGGE图谱进行分析。1.2.7实时荧光定量pcrq-pcr1.2.7.c、bifid的构建应用已知数量的乳杆菌属和双歧杆菌属参考菌株绘制扩增标准曲线,未知样品中乳杆菌属和双歧杆菌属的定量分析以扩增标准曲线为依据,同时设阴性对照(不加模板)及阳性对照。分别选取引物Lac和Bifid,在95℃预变性20s;95℃变性5s,60℃(乳杆菌属)、58℃(双歧杆菌属)退火30s,72℃延伸45s,循环40次;72℃终端延伸5min的条件下进行PCR扩增。实时荧光定量PCR(q-PCR)反应在20μL体系中进行,包括SuperMIX(SYBRGreen)10μL,模板2μL,上、下游引物各0.5μL,Dye0.25μL,加无菌去离子水至20μL。最后采用DPS软件中单因素方差分析方法进行统计学处理,所得结果经对数转换后以均值±标准差(ˉx±s)(x¯±s)表示。1.2.7.引物筛选及其扩增分别以0d粪便样品中拟杆菌门和梭菌属的数量为参照,并设为1,测定9、18、30和42d时粪便样品中以上两种菌门和菌属的相对数量,所得结果经对数转换后以均值±标准差(ˉx±s)(x¯±s)表示。分别选取引物Bfra和Ccoc,在95℃预变性20s;95℃变性5s,58℃(拟杆菌门)、55℃(梭菌属)退火30s,72℃延伸45s,循环40次;72℃终端延伸5min的条件下进行q-PCR扩增,反应体系同上述绝对定量体系。采用OriginPro7.5分析软件建立平滑线散点图。2结果2.1身体发育情况分别对A组大鼠和B组大鼠在0、18和42d的体重建立平滑图(图1),高脂模型大鼠体重虽略高于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05),说明各组大鼠身体发育生活状况基本相似。实验期间,观察各组大鼠生长状况良好,日常活动无异常。由表2可知,大鼠在摄食高脂饲料18d后即可建成高血脂动物模型,通过在基础饲料中添加8.0%猪油、1.0%胆固醇和0.3%牛磺胆酸钠的高脂饲料配方,诱导血清胆固醇浓度的升高。2.21pcr扩增产物的片段大小及大小用V3F+GC和V3R+GC引物对分别扩增A组和B组肠道菌群的16SrRNA的V3可变区,以确定其能够进行有效扩增及扩增出的片段在后续的DGGE分析中能够被完全分开(<500bp),见图2所示,本实验PCR扩增产物的片段大小约为320bp。2.3大鼠肠道菌群的结构对两组大鼠的肠道菌群基因组的V3区进行PCR-DGGE(图3)分析发现,在实验起始时(0d),排除大鼠个体差异,A、B两组大鼠的肠道菌群结构十分类似,有多条明亮主条带属两组共有;而到第42天,两组大鼠肠道菌群的差异已十分明显,许多明亮主条带出现组间差异性,A组条带丰度明显好于B组。从A组中选取1个代表性样品的三条差异性显著条带a、b、c进行胶回收,并克隆测序,所得测序结果见表3,从比对结果可知,主要的差异性条带为多形拟杆菌和不可被培养的细菌菌种。2.4q-pcr的结果2.4.1肠道菌群内的乳杆菌和双歧杆菌属变化情况乳杆菌属和双歧杆菌属的扩增标准曲线分别见图4所示。以标准曲线为依据,计算出未知样品中乳杆菌属和双歧杆菌属的数量,如表4所示。从荧光定量PCR的结果来看,随着时间的递增,A组肠道菌群内的优势菌群乳杆菌属和双歧杆菌属均无明显变化。B组乳杆菌属的改变呈现出整体性的下降趋势,第9、18和30天较0d明显降低且差异具有统计学意义(均P<0.01),而30d到42d这一时间段,乳杆菌的下降趋于缓慢。B组双歧杆菌属的变化趋势整体也呈下降,而0d到9d,差异无统计学意义,9d到42d明显降低且差异有统计学意义(P<0.01)。上述两组试验均表现出了随着高脂饲料饲喂时间的递增,乳杆菌属和双歧杆菌属的量都在减少,相较乳杆菌属,双歧杆菌属前期下降趋势比较缓慢。2.4.2高脂饲料剂量对拟杆菌门和梭菌属的影响分别以0d时各组中的拟杆菌门和梭菌属量为参照,设为1,相对定量组内其他时间的拟杆菌门和梭菌属含量,且每组的数值为此组内12只大鼠的平均值,所得结果如图5所示。随着高脂饲料饲喂天数的增加,拟杆菌门的相对量在减少,且趋势比较平缓。而梭菌属的量在增加,且增幅相较拟杆菌门的变化幅度更大。3微生态基因组的定量和相对定量问题高脂血症是多因素疾病,本实验从菌群数量的变化上讨论了肠道菌群与高脂血症发生发展的关系。宿主血脂过高和肠道微生物间存在复杂的相互作用,一方面表现为细菌影响脂质代谢,主要着眼于不同肠道微生物对食物中能量摄取效率的不同、肠道菌群的结构影响宿主肠道内脂质的吸收和积累以及肠道菌群中革兰阴细菌的脂多糖引起低水平慢性炎症反应。另一方面表现为动物血脂过高对肠道细菌也有一定影响,但机制尚不明确,这可能与宿主影响肠道微生物的生存环境有关,从而影响到其新陈代谢和生长繁殖。系统中的一个环节的变化预示着其他环节也可能发生相应的变化,肠道微生物一方面通过改变自身的结构和基因表达来自下而上应对这种选择压力,另一方面由于复杂生态系统的功能冗余性,保证了菌群重要功能的实现,这两种选择性力量相互影响并最终达到平衡。高脂血症人群与正常人群之间的肠道菌群的差异也正是建立在这样一种利益最大化的基础之上,至于血脂过高状态下,宿主和菌群究竟通过什么机制互相施加影响,还有待于进一步的研究。本研究通过微生物分子生态学技术结合统计学分析对膳食诱导高脂血症大鼠和正常大鼠的肠道菌群结构进行了研究,所使用的PCR-DGGE和q-PCR克服了传统培养技术的缺陷和限制,能够对微生态基因组总DNA进行较全面完整的分析,结合统计学分析可以对微生物的种类以及相对量做到定量或定性分析,从而大大提高研究的效率和精确度。通过PCR-DGGE技术虽然能够揭示两组动物肠道菌群种类和数量上的差异,显示高脂模型大鼠的肠道菌群丰度明显差于正常模型大鼠,但是胶回收克隆测序的结果未能成功鉴定出两组的差异性菌属或菌种。这可能是由于在胶回收的过程中回收的片段浓度较低,并且在再次扩增的过程中发生了错配,进而影响了下游测序结果。本研究选择与体脂和血脂沉积密切相关的乳杆菌属、双歧杆菌属和拟杆菌门、梭菌属分别进行q-PCR绝对定量和相对定量。结果表明,高脂饮食导致了肠道菌群的结构变化,益生菌(乳杆菌属、双歧杆菌)及常规共生菌(拟杆菌)数目的下降和梭菌属数目的增加,将对机体的体脂和血脂产生不利影响。乳杆菌属和双歧杆菌属的减少与文献报道过的高脂饮食对双歧杆菌的抑制作用相符,这可能由于高脂血症时肠道中微生物赖以生存的环境发生了改变,从而影响了乳杆菌和双歧杆菌的新陈代谢及生长繁殖,使得其数量明显较少;另一方面肠道菌群的失调也加重了脂质代谢紊乱,乳杆菌和双歧杆菌均可通过产生结合胆汁酸水解酶来影响胆汁酸的肠肝循环,促使肝脏利用胆固醇合成胆汁酸增加,这样使血中的胆固醇更多的被转化为人体无法吸收的粪甾醇,进而实现降血脂的作用。这种菌群失调和脂质代谢的相互影响在高脂血症的发生发展中起着重要的作用。拟杆菌门数量的减少与刘祥及BACKHED等的有关拟杆菌属可能通过促进对植物中多糖的的消化吸收及抑制体内fiaf酶的产生而导致脂肪积累和促进肥胖及高脂形成的报道不一致,这可能由于一方面大多数微生物目前还难以在实验室分离和培养,而刘祥使用活菌培养计数法并不能客观而全面地反映肠道菌群的结构特征和动态变化。另一方面拟杆菌门包