药物分析 第五章体内药物分析

第五章体内药物分析PharmaceuticalAnalysisinBiologaicalSamples2体内药物分析：体内样品中药物及其代谢物或内源性生物活性物质的定量分析。

建立在临床药理学(Clinicalpharmacology)、生物药剂学(Biopharmacy)和现代药物分析学(Modernpharmaceuticalanalysis)基础上的新型学科。1、掌握体内药物分析的特点和应用，体内样品分析的前处理、体内样品分析方法验证的内容2、熟悉体内样品的采集与制备方法、体内样品分析方法验证的技术要求3、了解体内药物分析的重要性质与意义【大纲要求】个体差异体内浓度差异疗效不同4化学等价而生物学不等价

药理作用强度与作用部位的浓度直接相关疗效吸收分布代谢5血液尿液唾液脏器活性代谢物内源性活性物质去除蛋白缀合物水解化学衍生化分离浓集体内6

质量评价药物研究临床应用方法药代动力学毒代动力学对象人试验动物7任务：方法学研究为新药研究提供基本数据为治疗药物监测（TherapeuticDrugMonitoring，TDM）提供数据。内源性物质的测定和研究滥用药物的检测8体内样品特点采样量少，不易再获得待测物浓度低干扰物质多9◆采样量少◆待测物浓度低◆干扰物质多◆需前处理◆方法灵敏度及专属性要求高◆工作量大◆色谱分析法◆免疫分析法◆生物学方法10SomeanalyticaltechniquesGasChromatography/GC-MSHPLC/HPLC-MS/MS/ChiralHPLCHPLC-TOF-MSRadioimmunoassayRIAEnzymeimmunoassayEIA11一、体内样品的种类血样：药物浓度与治疗作用的关系。尿样：用于药物剂量回收、尿清除率唾液：代替血浆游离浓度进行临床监测，药物动力学研究。组织：药物在脏器的分布情况头发：体内微量元素、用药史、毒性药物监测第一节常用体内样品的制备与贮藏

二、体内样品的采集与制备血样：血样采集

（静脉采血）血浆的制备血清的制备12静脉血置含抗凝剂试管1000×g离心5-10min淡黄色上清液静脉血置试管放置30-60min1000×g离心5-10min淡黄色上清液（二）尿样特点浓度高，收集量大，易受饮食、排汗干扰采集自然排尿，随时尿、晨尿、白天（夜晚）尿以及时间尿贮藏加入适当防腐剂13唾液一些药物唾液浓度与血浆游离浓度密切相关组成：水、盐、蛋白质采集：漱口后15min3000r/min离心10min取上清组织制备处理1415三、体内样品的贮存与处理冷藏和冷冻：血浆和血清需要在采血以后及时分离，一般最迟不超过2小时长期冷冻（-20℃或-80~-70℃）去活性：采样后立即终止酶的活性。例：班布特罗（毒扁豆碱）第二节、体内样品分析的前处理分析测定分离改性浓集1617一、预处理的目的使待测药物游离满足测定方法的要求改善分析环境18二、常用体内样品预处理方法19去蛋白分离、浓集缀合物水解衍生化其他（一）去除蛋白质溶剂解法常用溶剂乙腈、甲醇体积比：1：2～390％去除方法：超速离心（15000g/min）5min202、加入中性盐常用中性盐：饱和硫酸铵、硫酸钠、磷酸盐、枸橼酸盐比例：1：290％去除方法：超速离心（15000g/min）213、加入强酸常用溶剂10％三氯醋酸、6％高氯酸、硫酸－钨酸混合液、5％偏磷酸体积比：1：0.690％去除方法：超速离心（15000g/min）22示例：注射用头孢他啶-舒巴坦钠(2:1)

人体药代动力学试验临床研究精密取血浆样品0.2mL于置1.5mLEP试管中，加入内标溶液（头孢氨苄，1mg/mL）20μL，涡旋混匀，准确加入6%高氯酸水溶液0.6毫升，漩涡振荡1.5分钟，14000以上离心速度（离心力不小于15000克）离心5分钟，取上层0.6毫升至预先加入0.06毫升保护剂的进样瓶中，摇晃10秒使其均匀，进样20μL，记录头孢他啶及内标峰面积，内标法计算头孢他啶的浓度2324ABAB图1空白血浆加舒巴坦色谱图图2空白血浆加入头孢他啶和头孢氨苄的色谱图（A）头孢他啶

（B）头孢氨苄

图3受试者给予1.5g头孢他啶-舒巴坦（2:1）受试制剂30min时血浆色谱图(A)头孢他啶

(B)头孢氨苄（二）分离、纯化与浓集液－液提取法（LLE）大多数药物都是脂溶性的，内源性物质基本上都是水溶性的，当用有机溶剂萃取时，药物被萃取出来而内源性物质被除去，因此采用有机溶剂萃取法能够达到纯化的目的。25关键要考虑三个方面的因素有机溶剂的特性有机溶剂相和水相的体积水相的pH值26溶剂选择原则：27（1）要求对分子型药物易溶，离子型药物不溶（2）沸点低、易挥发和浓缩（3）要与水不相溶（4）不易乳化（5）具有较高的化学稳定性和惰性（6）不影响检测溶剂的选择282、有机相和水相的体积：一般为1:1～1:23、水相的pH值：碱性药物→pH>pKa+1～2

酸性药物→pH＜pKa+1～24、提取次数：往往进行的是一次萃取，个别情况下可以对分离出的含药有机相用一定的pH水进行反萃取（Backextraction)29优点：选择性；药物能与多数内源性物质分离缺点：乳化、有毒、不环保、不自动

对极性大的化合物的萃取效率低总的流程图：血浆或其他生物样品加入萃取溶剂分取有机层必要时调pH值减压氮气吹干流动相溶解后进样分析示例：盐酸曲美他嗪缓释片生物等效性研究精密量取血浆样品200μl，置2mlEP管中，精密加入甲醇-水（1：1）溶液20μl，精密加入内标溶液（200.0000ng/ml丁咯地尔）20μl，加入碱化试剂（1mol/LNaOH溶液）50μl，涡旋混合30秒，加入提取溶剂甲基叔丁基醚2ml，涡旋混合1分钟，离心（14000rpm）5分钟，分取上层有机相，于40℃水浴中空气流吹干，残留物加流动相200μl，涡旋混合1分钟，离心（14000rpm）3分钟，取上清液180μl进样分析。3031图1-3空白血浆色谱图Ⅱ图1-4待测物曲美他嗪（10.0000ng/ml）与内标物丁咯地尔（20.0000ng/ml）的血浆样品色谱图

322、固相萃取(Solidphaseextraction,SPE)（1）原理根据液相萃取的原理，利用液相中溶质与吸附剂间的选择性吸附与洗脱原理。当液相流经吸附剂后，一些小分子药物被吸附，经适当洗涤除去杂质，再用少量溶剂洗脱，可达到分离、纯化目的。决定因素：药物与固定相表面的活性基团、药物与溶剂分子间的分子间作用力33洗脱方式：（1）药物与固定相的亲和力>杂质与固定相的亲和力－先被保留后解吸（2）药物与固定相的亲和力<杂质与固定相的亲和力－直接洗脱34

可弃性柱、操作步骤少、使用溶剂少、节省实验费用和时间35（2）SPE方法建立－以亲脂性键合硅胶为例1、以甲醇润湿小柱，活化填料，甲醇含量8％2、用水或缓冲液冲洗小柱，洗去多余的甲醇3、上样，弃去废液4、用水或缓冲液冲洗小柱除去水溶性杂质5、用合适的洗脱剂洗脱小柱，收集洗脱物6、回收溶剂后进行分析和监测36实验中的注意事项1、体液样品可直接上柱，上样体积在0.1～2.0ml2、洗脱流速在1～2ml/min3、萃取介质中含有少量的甲醇可以提高萃取率4、萃取碱性药物时，常需在洗脱机中加酸、有机胺、醋酸铵或离子对试剂5、选用苯基和氰基柱时，需用极性溶剂如丙酮洗脱6、选用反相硅胶柱时，少量的甲醇和乙腈即可完成洗脱37SPE方法的优点：1、引入的杂质少2、可以完全避免乳化的形成3、有较高的萃取回收率，重现性好4、小柱可弃，没有污染5、需要的样品量少6、洗脱溶剂多为水溶性的，易于实现自动化38SPE的缺点：1、价格昂贵2、技术要求高3、小柱各批之间有差异4、主子容易堵塞，影响分离效果39一、分析方法的建立分析方法的选择色谱分析法、免疫分析法、生物学分析法分析方法建立色谱条件的筛选色谱条件的优化实际样品的测试第三节、体内样品分析方法与方法验证401、生物样品量少2、浓度低3、内源性物质的干扰4、生物的个体差异较大二、分析方法的验证41

用于实际生物样品分析之前： 需要验证

(validation)分析方法的可行性与可靠性 方法验证时应考虑影响分析方法的所有可变因素：采样、样品制备、色谱分离、检测与数据评价 使用的技术指标

—效能指标 使用的样品

—通常采用模拟生物样品和用药后的实际生物样品42验证步骤

首先为分析方法的验证

—特异性、精密度与准确度、回收率、定量限与检测限、溶液稳定性 其次为生物基质中待测药物稳定性的验证

—室温放置、冷冻（或冷藏）、冻-融循环

Freeze-and-thawcycle43验证的效能指标与基本要求

1．特异性—避免干扰

2．标准曲线与定量范围—覆盖所有浓度范围

3．定量下限—达到峰浓度的1/10～1/20

4．精密度与准确度—结果可重现与实际状况相符

5．稳定性—确保所有样品准确测定

6．提取回收率—确保准确度7．分析方法的质量控制8.未知生物样品浓度超出定量范围的处理44（一）、方法特异性

方法的特异性(specificity)

—又称专属性或专一性，通常与选择性(selectivity)互用

—系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质的能力

专属性—表示所检测的信号(响应)系属于待测药物所特有 选择性—系指将待测物质与其代谢物及同服的其它药物加以区分(分离)的能力

特异性—函盖二者，以验证所测定的物质与待测药物的同一性 考察一个分析方法是否具有特异性，应着重考虑以下几点：451.内源性物质的干扰

比较—待测药物或其活性代谢产物检测信号 对照品（或标准品） 空白生物基质 模拟生物样品（空白生物基质中添加对照品）

—如HPLC色谱峰的tR、n和T是否一致 及与内源性物质色谱峰的R

确证—内源性物质对分析方法有无干扰462.代谢产物的干扰

比较模拟生物样品和用药后的实际生物样品的检测信号与代谢产物的R

如HPLC色谱峰的tR、n和T〔或改变色谱条件(色谱柱)再比较〕来确证其它代谢产物对分析方法有无干扰

473.联合药物的干扰

TDM时

—还要考虑患者可能同时服用药物的干扰 通过比较待测药物及可能同时服用药物的模拟生物样品的检测信号 如HPLC色谱峰的tR、n和T是否一致

来确证同时服用药物对分析方法的干扰情况48精密量取4名受试者空白血浆200μl，置2mlEP管中，精密加入乙腈40μl，按“血浆样品处理方法”项下自“加入碱化试剂（1mol/LNaOH溶液）50μl”起同法试验。得色谱图1-3；精密量取空白血浆200μl，置2mlEP管中，精密加入曲美他嗪标准溶液（102.4000ng/ml）20μl和内标溶液（200.0000ng/ml丁咯地尔）20μl，按“血浆样品处理方法”项下自“加入碱化试剂（1mol/LNaOH溶液）50μl”起同法试验，得色谱图1-4；精密量取受试者13单次口服受试制剂0.75小时后的血浆样品200μl，置2mlEP管中，按“血浆样品处理方法”同法试验，得色谱图1-5。上述色谱图结果表明曲美他嗪的保留时间为3.16分钟左右，丁咯地尔的保留时间为1.96分钟左右，血浆中内源性物质不干扰曲美他嗪和内标物丁咯地尔的测定（Ⅰ为曲美他嗪，Ⅱ为丁咯地尔）。4950二、标准曲线与定量范围标准曲线（standardcurve）—calibrationcurveorworkingcurve

—生物样品中所测定药物浓度与响应的相关性（比例的程度）

—通常用回归分析方法所得的回归方程来评价

—除少数方法（免疫分析法）外，标准曲线通常为线性模式

—回归分析法为最小二乘法（leastsquares）或加权最小二乘法（weightedleastsquares） 线性范围（linearrang）—标准曲线的最高与最低浓度的区间

—模拟生物样品的测定结果应达到试验要求的精密度和准确度51（二）、标准曲线与线性范围

标准曲线—用模拟生物样品建立—范围(不包括零点)应覆盖全部生物样品中的药物浓度—不能使用外推的方法求算未知生物样品中的药物浓度

建立标准曲线所使用的模拟生物样品应使用与待测的含药生物样品相同的生物基质制备52标准曲线的一般建立方法标准系列溶液的制备内标溶液的制备标准系列模拟生物样品的制备标准曲线的绘制加权最小二乘法限度要求53标准曲线的一般建立方法

1.标准系列溶液的制备标准物质－对照品、标准品 溶剂—水或甲醇（或其他适当溶剂） 浓度—模拟生物样品中药物浓度的50倍以上 加入量为生物样品总体积的2%以下 避免标准模拟生物样品与实际样品存在较大差异 浓度较低—应除去溶剂后再加入生物基质 否则,在实际样品测定时应加入等体积的溶剂并涡旋混匀54

至少含5～8个浓度点(不包括零点,即空白) —可覆盖全部待测生物样品中的药物浓度 如：1、2、5、10、20、50、100(等比梯度模式—比例常数约为2)

若体内平均达峰浓度为50，其1/20为2.5

设定最高浓度为100，最低浓度为1(个体差异)552、内标溶液的制备内标物质－对照品、标准品或化学试剂适宜的溶剂－甲醇、水、乙腈或混合溶剂浓度－与标准系列溶液的中间浓度相当如：某标准溶液5、10、20、40、80、160、320μg/ml，则内标的浓度应配制成40μg/ml563.标准系列模拟生物样品的制备

空白生物基质(如血浆)—加入标准系列溶液适量，涡旋混匀 为防止在标准溶液加入及涡旋混合时造成的损失

——①先加入标准溶液

②再加入空白生物基质 ③涡旋混匀①②③574.标准曲线的绘制

以待测药物的检测响应(如色谱峰面积或峰高)或与内标物质的检测响应的比值(内标法)(因变量,y)对模拟血药浓度(自变量,x)

—求得回归方程(y＝a＋bx)及其相关系数(

)

在一组由至少7个浓度(不包括零点)构成的标准曲线中，至多可有2个浓度点数据，可予剔除。但应有确切原因，如：（1）样品处理有损失；（2）色谱图有问题；（3）显著偏离标准曲线

—其余应有至少5个浓度点在标准曲线上58加权最小二乘法

普通最小二乘法—每个浓度点绝对误差(yi－yi’)赋予同等的重要性

标准曲线上的高低浓度相差悬殊(范围达102)

—低浓度区的计算值相对误差过大，难以满足规定要求。加权最小二乘法—回归计算时增加一个权重因子(w)

—各浓度的响应值与回归值的相对离差平方和达到最小式中，wi为标准曲线上第i个浓度点的权重因子592）权重因子的选择

加权—赋予低浓度点以更大的权重 在实际工作中的一般方法 （1）当wi=1/(yi’)2时，则 （2）而yi与xi成正比 （3）所以，令wi=1/(bxi)2=k/xi2(通常取wi=1/C2)

当高浓度点测量值的准确度下降过大 低浓度点权重过大，降低低浓度点的权重，wi=k/xi60标准曲线的限度要求

药代动力学或生物利用度研究

—标准曲线至少包括5个浓度(通常为5～8个浓度,不包括零点)

—最高浓度应高于达峰浓度(Cmax)；最低浓度应低于Cmax的10%～5%，并应为方法的LOQ(非LOD)

—回归方程的截距应接近于零，b≥使之具有较高的灵敏度

—相关系数要求

≥0.99(色谱法)或≥0.98(生物学方法)

—若非线性，可分为高低两个浓度区间(每个区间不少于5个浓度)，分别加权回归—如1、2、5、10、20和10、20、50、100、20061精密量取空白血浆200μl，置2mlEP管中，分别精密加入不同浓度曲美他嗪标准系列溶液各20μl，配制成血浆中曲美他嗪浓度为0.5000，1.0000，2.5000，10.0000，50.0000，100.0000，200.0000ng/ml的血浆样品，按“血浆样品处理方法”项下自“精密加入内标溶液（200.0000ng/ml丁咯地尔）20μl”起同法试验，每一浓度进行双样本分析，制备曲美他嗪的标准曲线。以待测物浓度与内标物浓度比值为横坐标X，待测物与内标物的峰面积比值（As/Ai）为纵坐标Y，用加权最小二乘法[3]（权重系数：W=1/X2）进行线性回归运算，求得的线性回归方程即为标准曲线方程。结果表明，曲美他嗪在0.5000～180.0000ng/ml范围内待测物和内标物峰面积之比线性关系良好，浓度测定结果均达到试验要求的精密度与准确度[1]。6263（三）、定量限

方法定量限(limitofquantitation，LOQ) —系指在保证具有一定可靠性(准确度与精密度符合要求)的前提下，能测定出生物样品中药物的最低浓度,又称为方法灵敏度(sensitivity) —标准曲线上的最低浓度点

64同一生物介质，5个独立的标准样品浓度大于（S/N）＝5。1、测定法65LODTestS/N＝566要求—应能满足测定3～5个消除半衰期后生物样品中的药物浓度或Cmax的10％～5％) —准确度在80%～120%(或RE在±20%的范围内) —RSD≤20%2、限度要求67（四）、精密度与准确度

方法精密度(precision) —系指确定的分析条件下相同生物介质中相同浓度样品的

一系列测量值的分散程度，QC的RSD

—包括批内和批间RSD —反映分析方法的可操作性，是方法验证的基本要点之一 —使用模拟生物样品测定68

方法准确度(accuracy) —系指用该方法测得的生物样品中待测药物的浓度与其真实浓度的接近程度

—应使用实际生物样品测定，但实际生物样品的浓度是未知的所以，通常使用模拟生物样品测定

—一般用相对回收率(relativerecovery，RR)或相对误差(relativeerror，RE)表示691.测定法

高、中、低3个浓度的QC，每一浓度n=5，连续3个分析批 批间RSD=

批内RSD= =70

计算

—测定值M(measured)的平均值与理论浓度(加入值)A(added)比值 相对回收率 相对误差 限度要求

—相对回收率应在85%～115%(LOQ附近80%～120%) —RE在±15%(LOQ附近为±20%)71（五）、稳定性在生物样品的分析中，需要对样品的存放条件和时间进行考察，以保证分析结果的准确、可靠方法稳定性考察生物样品的稳定性考察相关稳定性的测定方法与要求72生物样品的稳定性短期稳定性主要考察模拟生物样品在室温、4℃或－20℃以及冻－融循环条件下的稳定性长期稳定性主要考察生物样品长期冰冻（－20℃或－80℃）后的稳定性73测定方法与要求1、取高、中、低三个浓度的QC样品，在不同条件下存放不同时间后，每个样品重复测定三次