蛇床子素抑制血栓形成和血小板聚集的实验研究

蛇床子素抑制血栓形成和血小板聚集的实验研究

蛇床子素也被称为甲基欧芹酚（ost），是从伞科植物的蛇床子成熟的果实蛇床子中提取的。它的化学特征是7-甲基-8-异戊烯基香豆素。文献报道蛇床子素对心血管系统、中枢神经系统、免疫系统、抗肿瘤等方面有广泛的药理作用。本文以实验性血栓形成和血小板聚集为指标,观察蛇床子素的抗血栓作用,目前国内外尚无这方面的研究报道。1材料表面1.1体重、体重Wistar大鼠,♂,体重200~250g;昆明种小鼠,♂,体重18~22g。均由苏州大学实验动物中心提供,清洁级,实验动物生产许可证:XCYK(苏)2002-0008,实验动物使用许可证:SYXK(苏)2002-0037。1.2承载物、激素的药物及药物蛇床子素(纯度为95%,西安绿泉生物技术有限公司提供,体内给药时用体积分数为0.002的吐温-80配制,体外实验用体积分数为0.05的二甲亚砜配制);复方丹参滴丸(天津天士力制药股份有限公司);胶原-肾上腺素合剂(分别购自Sigma公司和上海禾丰制药有限公司。临用时称取胶原蛋白45mg,浸泡于3~4ml生理盐水中2h以上,匀浆,1000×g离心10min,取上清液;另取1g·L-1的肾上腺素1.8ml,加入上清中,加生理盐水至40ml即成);ADP(北京世帝科学仪器公司);凝血酶(珠海经济特区生物化学制药厂);花生四烯酸钠(Sigma公司);丹参注射液(正大青春宝药业有限公司)。1.3仪器TYXN-96多功能智血液凝聚仪(上海通用机电技术研究所)。2方法2.1蛇床子素的灌胃将大鼠随机分成五组:①阳性药物对照组:复方丹参滴丸(CoumpoundDanshenDrippingPills,CDDP)溶液灌胃(62.5mg·kg-1·d-1);②③④蛇床子素组,分别以10,20,40mg·kg·d-1蛇床子素溶液灌胃;⑤模型组:以等体积的体积分数为0.002的吐温-80溶液灌胃。连续给药10d,在末次给药后0.5h,参照文献方法制成动-静脉旁路血栓形成模型。即麻醉大鼠,取三段聚乙烯管组成套管,中间套管内置一预先称重的6cm长丝线。管的一端插入大鼠的左颈外静脉后,向管腔内注入肝素(50U·kg-1),然后再将管的另一端插入右侧颈总动脉。开放血流,15min后中断血流,迅速取出丝线并称重。血栓湿重由总重量减去丝线干重表示。然后将血栓放入70℃烘箱,2h后称干重。血栓干重由总重量减去丝线干重表示,并按下式计算血栓形成抑制率:血栓形成抑制率(%)=模型组血栓重量-给药前血栓重量模型组血栓重量×100%2.2蛇床子素及吐温-80溶液将小鼠随机分成五组:①阳性药物对照组:阿司匹林(aspirin)溶液灌胃(20mg·kg·d-1);②③④为蛇床子素组,别以10,20,40mg·kg·d-1蛇床子素溶液灌胃;⑤模型组:以等体积的体积分数为0.002的吐温-80溶液灌胃。连续给药7d,在末次给药后0.5h,尾静脉注入胶原-肾上腺素混合溶液0.01ml·g-1,观察5min内小鼠的死亡数和15min内小鼠偏瘫的恢复数,计算小鼠的死亡率和药物对小鼠偏瘫的保护率。2.3血小板聚集测定取健康志愿者新鲜血液,按本室常法制备富血小板血浆(plateletrichplasma,PRP)或血小板悬液,用Born’s比浊法测定血小板聚集性。在200μlPRP或血小板悬液中加入不同浓度的蛇床子素溶液,阳性药为丹参注射液(DanshenZhusheye,DZ),溶媒对照为体积分数为0.05的二甲基亚砜溶液。37℃温育5min后,分别加入浓度为112.5μmol·L-1的ADP5μl、5U·ml-1的凝血酶20μl、32mmol·L-1的花生四烯酸钠5μl后描记5min血小板聚集曲线,观察1、3、5min时聚集率和最大聚集率。所有样本的血小板聚集测定均在3h内完成。聚集抑制率(aggregativeinhibitionrate,AIR)按下式计算,以抑制百分率为纵坐标,不同药物浓度为横坐标进行直线回归,按直线回归方程计算抑制50%血小板聚集的相应药物浓度(IC50),并以此比较药物对不同诱导剂产生血小板聚集作用的大小。血小板聚集抑制率(%)=溶媒管最大聚集率-给药管最大聚集率溶媒管最大聚集率×100%2.4数据处理血栓重量和血小板聚集率用ˉx±s表示,组间的显著性差异用t检验;率的比较用χ2检验。3结果3.1蛇床子素对大鼠血栓形成的影响大鼠连续10d给药后,蛇床子素10、20、40mg·kg-1组的血栓湿重和干重与模型组相比均明显降低。表明蛇床子素对大鼠体内血栓形成有明显的抑制作用,但高中低剂量组间的量效关系不明显。见Tab1。3.2动物死亡数及小鼠恢复数给予蛇床子素10、20、40mg·kg-17d的小鼠,对注射胶原-肾上腺素5min内诱导体内血栓形成所致的动物死亡数与模型组相比均明显降低,15min内偏瘫小鼠恢复数与模型组相比也明显增加。表明蛇床子素对胶原-肾上腺素诱导的小鼠血栓性偏瘫或死亡具有一定的保护作用。见Tab2。3.3种诱导剂的诱导的血小板聚集的抑制作用用健康人血,ADP、凝血酶、花生四烯酸钠作诱导剂,结果各个浓度下的蛇床子素对三种诱导剂诱导的血小板聚集均有不同程度的抑制作用,其IC50分别为0.444、0.186、0.421g·L-1。由此可见蛇床子素对凝血酶诱导的血小板聚集的抑制作用最强,对ADP和花生四烯酸钠的抑制作用基本相同。见Tab3,4,5。4抗凝血药的合成展望血栓栓塞性疾病是严重危害公众健康的常见病与多发病,是脑卒中、冠心病、动脉粥洋硬化等致残和致死率高的心脑血管疾病的主要病理学基础。目前现有的抗血栓药物依作用机制可分为抗凝血药、抗血小板药和纤维蛋白溶解药。抗凝血药包括肝素,AT-Ⅲ及直接抗凝血酶药,组织因子途径抑制剂等。其中肝素不能抑制与纤维蛋白结合的凝血酶,已成为血栓复发的关键因素。近年来,低分子量肝素及凝血酶抑制剂的研制,虽使抗凝血药的疗效与安全性有所提高,但总的来说,尚无理想的抗凝血药供临床使用;抗血小板药包括环氧酶抑制剂,TXA2受体阻滞剂和TXA2合成酶抑制剂,血小板GPⅡb/Ⅲa受体阻滞剂等。此类药物或作用不强,或半衰期太短,或无法口服等,限制其广泛应用;纤维蛋白溶解药包括第Ⅰ代的链激酶、尿激酶等,第Ⅱ代的t-PA、阿尼普酶等,第Ⅲ代制剂如改造野生型t-PA、组建嵌合型溶栓剂、单克隆抗体导向溶栓剂等。此类药物虽经历3代的研制和发展,溶栓效果和特异性逐渐有所改善,但尚未取得实质性和突破性进展,有不同程度的出血、再灌注损伤、过敏反应等副作用和溶栓后再栓塞等缺陷,以及用药时机和剂量不易掌握等问题。因此,研制有效、安全、适合于长期甚至终生服用的口服抗血栓药物具有重要意义。我国中医药研究表明,大量植物来源的单体化合物具有确切的抗血栓作用,与目前已经上市的抗血栓西药和生物技术产品相比,天然中草药安全性好,口服有效。因此,发展纯天然的抗血栓药物是目前研制新型抗血栓药物的有效途径。蛇床子素药理作用广泛,但对体内的抗血栓形成和抑