基因工程大实验开题报告

PAGEPAGE5学号内蒙古大学生命科学学院生物系基因工程实验室本科基因工程大实验开题报告论文题目：纳豆激酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达学生姓名：年级：专业：指导教师：年月日学生姓名民族性别出生年月论文题目纳豆激酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达开题时间结题时间项目来源本科生基因工程大实验课一、立论依据“纳豆激酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达”项目的选题和研究的意义，国内外研究现状及发展趋势分析，主要参考文献及出处：纳豆是日本传统的发酵食品，日本民间有“纳豆可以在一定程度上预防并治疗心血管疾病”的说法。后经研究发现,纳豆含有丰富的生理活性物质,具有抗血栓、降血压、预防癌症等多种显著的生理调节功能,越来越受到世界各国的重视[1]。纳豆激酶（nattokinase，NK）是一种枯草杆菌蛋白激酶，也是具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶。1987年由日本的须见洋行等首先发现，由于其具有无毒无副作用，体内半衰期长，成本低廉等其它溶栓剂无法比拟的优点，极有可能成为新一代抗栓药物[2]。研究发现，纳豆激酶能显著地溶解体内外血栓，明显缩短优球蛋白溶解时间，并能激活体内血管内皮细胞产生纤维蛋白溶酶原激活剂(t-PA)，从而增加内源性纤溶酶的量与作用，间接表现溶栓活性[3-5]。今后20年,我国将步入老龄化社会,血栓病是中老年人的高发病,是死亡威胁最大的疾病之一。现在使用的溶栓药物链激酶、尿激酶、组织型纤溶酶原激活剂等，在临床使用过程中存在稳定性差、药效短、易引起患者全身性出血等副作用，并且有半衰期短、来源短缺、成本高等缺点[6-7]。而纳豆激酶来源于传统发酵食品,生产工艺简单,无副作用,安全性高,符合治疗血栓病的药品或食品基料的要求。它的溶栓功效已得到各方认可。在日本、美国、韩国和朝鲜等国家都有大公司生产出多种以纳豆激酶为主要成分的产品,此外,我国在实施药品专利保护和知识产权保护后,新药的仿制将受到严格限制。因此研制新溶栓药物具有紧迫性。虽然国内外许多学者热衷于纳豆激酶的研究,渴望将其开发成为新一代的溶栓新药,但目前仍存在不足之处,如还未开发出纳豆激酶针剂等。而社会对高效、廉价的溶血栓类药物的开发要求非常迫切,因此纳豆激酶所具有的许多良好的生理调节功能和特殊的溶血栓活性使其成为了一种预防和治疗血栓及栓塞性疾病的理想药物,具有广泛的开发前景[8-10]。参考文献[1]SumiH,HamadaH,TsushimaH,etal.Experientia,1987,43(10):1110-1111.[2]余榕捷,谢秋玲,洪岸,等.中国病理生理杂志,2003,19(6):757-761.[3]NakamuraT,YamagataY,IchishimaE.BiosciBiotechBiochem,1992,56(11):1869-1871.[4]罗立新,黄志立,凌均建,等.华南理工大学学报,2002,29(4):59-62.[5]SCHUBERTM,PETERSSONUA,HAASBJ,eta.lProteomemapofthechloroplastlumenofArabidopsisthaliana[J].JBiolChem,2002,277(10):8354-8365.[6]张锋,金杰.西北农业学报,2005,14(3):159-162.[7]LINDERMAYRC,DURNERJ.S-Nitrosylationinplants:patternandfunction[J].JProteomics,2009,73(1):1-9.[8]张淑梅,张云湖,赵云祥,等.中国生物化学与分子生物学报,1999,15(6):912-915.[9]孙立娜.工企医刊,2008,21(2):57-60.[10]付利,杨志兴.纳豆激酶的研究与应用.生物工程进展,1995.二、实验方案实验内容和实验目标，拟解决的关键问题：1.1实验内容：①、NK的PCR扩增。②、PCR产物与pMD-19-T的连接。③、pET-trx与NK构建表达载体。④、转化E.coliBL21(DE3)，IPTG诱导表达⑤、SDS检测并观察。1.2实验目标：①、学习如何进行一个项目的前期准备工作，策划、论证等。②、通过实验培养将书本知识转化为实际操作的能力。③、培养良好的实验习惯，如记录实验数据，反思实验操作，解决实验问题。1.3拟解决的关键问题：①、目的基因的克隆和酶切。②、如何构建正确的过渡和表达载体。③、如何利用SDS检测表达蛋白。实验思路、方法、技术路线、实验方案及可行性分析：2.1实验思路及方法PCR克隆pMD18-T-NK克隆质粒上的纳豆激酶基因，将其与pMD19-T载体连接，转入DH5α感受态细胞筛选鉴定，然后用双酶（BamHI/EcoRI）切下相应基因片段，插入原核表达载体pET-trx中，在表达菌BL21(DE3)中诱导表达出蛋白质，最后利用SDS鉴定。2.2实验方案2.2.1克隆NK基因通过PCR利用给定引物和条件克隆pMD18-T-NK中的NK基因。2.2.2表达载体的构建将NK基因与pMD-19-T连接过夜，将构建的质粒转入已制备好的DH5α感受态菌中。EcoRI和BamHI双酶切pMD-19-T-NK质粒和表达载体pET-trx，电泳回收NK片段和pET-trx载体，连接，构建重组质粒pET-trx-NK。将pET-trx-NK转化E.coliBL21(DE3)，抗生素筛选，提质粒pET-trx-NK电泳鉴定。2.2.3诱导表达并鉴定NK基因鉴定正确后，IPTG诱导表达，SDS检测。2.3技术路线pMD1pMD19-T-NKpET-trx扩增NKpMD19-TBamHI/EcoRI回收片段连接pET-trx-NKIPTG诱导表达SDSDH5αBL21(DE3)pMD18-T-NK2.3可行性分析①、实验室的各类仪器完好、试剂齐全。②、实验的各项操作从提取质粒到IPTG诱导、SDS均在课本中有所涉及且发展得十分成熟。③、师兄师姐在纳豆激酶的实验中已有多次成功的经验。④、NK基因中不含内含子，可以在原核生物中表达。由此可见，本实验“纳豆激酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达”会取得预期的成功。3.实验进度（10天之内）：第一天下午：领取、查看实验器材，灭菌，配溶液，接种E.coliDH5α、BL21（DE3）至LB培养基37℃振荡培养过夜。第二天上午：制备DH5α、BL21（DE3）感受态细菌。下午：PCR扩增NK基因，电泳检测。晚上：扩增的NK基因与pMD19-T连接过夜，接种E.coliPET-trx至LB培养基37℃振荡培养过夜摇菌。第三天上午：pMD19-T-NK转化E.coliDH5α，摇菌，涂板，提取E.coliPET-trx质粒。第四天上午：提取转化了pMD19-T-NK的E.coliDH5α的质粒，电泳检测。下午：BamHI/EcoRI酶切pET-trx、pMD19-T-NK电泳鉴定。晚上：回收片段，连接过夜。第五天上午：重组质粒转化BL21（DE3）感受态菌，摇菌，涂板。第六天上午：选择经过抗生素抗性筛选的菌落，摇菌，电泳鉴定，加入IPTG诱导表达蛋白。第七天SDS检测表达蛋白，观察脱色胶，照相。4.预期实验成果：纳豆激酶能在BL21大肠杆菌中表达，且SDS检验后观察到一条代表28KD左右的带，表示有蛋白质的表达，且根据条带粗细的不同可以判断出NK表达量的多少。5.曾参与与本实验有关的学习和研究工作积累以及已取得的工作成绩：（学过基因工程课程、读过相关的文献、写过有关的综述、参加过相关的实验设计或研究课题、获得过相关的学术奖励情况等）6.请运用已学过的课堂知识结合看过