尼罗红荧光染色在小球藻中的应用

尼罗红荧光染色在小球藻中的应用

微藻具有丰富的脂质、高效率、适宜环境、短生长周期长、生物产量高等特征。它是国内外生物生产的理想原材料。筛选脂质含量高的微藻,成为当前能源微藻资源开发研究中的热点和难点。微藻细胞内的脂质含量是决定以微藻为原料制备生物能源的关键,也是能否实现商业化生产的主要因素之一。目前,传统的微藻脂质测定方法主要是有机溶剂提取称重的方法,但原料需求量大,效率低,安全性差,存在一定的局限性,无论是对优良藻种的筛选,培养条件的优化或是藻采收时期的确定,建立快速简便低能耗的微藻脂质测定方法尤为重要。尼罗红(9-diethylamino-5H-benzo[a]phenoxazine-5-one)是一种脂溶性的荧光染料,能够与脂类物质(包括甘油酯、磷脂、蜡以及各种脂肪酸)相结合,选择合适的激发波长可显示强烈桔红色荧光(发射波长480nm)。因此,可以利用尼罗红与脂类物质结合发出的荧光检测信号,对细胞内的脂类含量进行快速、灵敏、可靠的活体定量测定。这种方法被广泛用于各种细胞,也被成功作为荧光探针检测Isochrysisgalbana,EmilianiaHuxleyi和Crypthecodiniumcohnii等一些藻类的脂质含量。目前该方法应用较多是属于硅藻纲、黄藻纲、褐藻纲的藻,而很少有应用到绿藻纲中。传统的尼罗红染色是以水溶液为媒介进行染色的,以往研究发现属于绿藻纲的一些小球藻的脂质并不能用该方法测定,可能是由于较厚的细胞壁组成和结构阻止了尼罗红染料穿透细胞壁和细胞质膜,使其不能有效地与胞内脂质相结合。小球藻是一类重要的可以作为脂质来源的微藻,为了能用尼罗红荧光法分析这一类藻细胞中的脂质,本文以4株小球藻为材料,通过物理和化学的预处理,提高尼罗红染色的有效性,优化尼罗红荧光法检测胞内脂质的条件,建立便捷快速的检测小球藻细胞内脂质含量的方法。1材料和方法1.1角褐指藻藻株选用了4株小球藻ChlorellapyrenoidosaNo.1、ChlorellapyrenoidosaNo.2、ChlorellavulgarisNo.1、ChlorellavulgarisNo.2和1株三角褐指藻Phaeodactylumtricornutum(均来自中南民族大学生命科学学院发酵工程实验室),经抗生素法制备无菌藻株。1.2培养基和试剂小球藻的活化和培养采用改进的Bristol’ssolution培养基(g/L):NaNO30.25,K2HPO4·3H2O0.075,MgSO4·7H2O0.075,CaCl2·2H2O0.025,KH2PO40.175,NaCl0.025,FeCl3·6H2O0.005,Fe-EDTA(0.49g/L)1mL,A5微量元素液1mL。其中A5微量元素液(g/L):ZnSO4·7H2O0.22,H3BO32.86,MnCl2·4H2O1.81,CuSO4·5H2O0.079,(NH4)6MO7O24·4H2O0.039,土壤提取液1mL。Phaeodactylumtricornutum采用f/2培养基。250mL三角瓶中装100mL液体培养基,接种量10%,28℃静置培养,光照强度4500lx,光暗比为12∶12(h/h),每日随机调换三角瓶并摇动2~3次悬浮藻细胞。1.3荧光强度的测定取培养至对数生长期后期的藻液适量,8000r/min离心5min,去除上清,藻细胞沉淀用PBS缓冲溶液洗两次,用PBS重悬藻细胞至OD540值0.8,1mL藻液加15μL尼罗红染料(质量浓度为0.1mg/mL丙酮溶液),室温下混匀染色5min,激发波长480nm,测定其在575nm波长的荧光强度。除了特殊说明,以下所有实验均做3个平行。1.4脂质层的提取提取溶剂为氯仿-甲醇混合溶液(体积比为2∶1),室温下在0.3g藻粉中加入3mL提取溶剂,超声提取约10min,6000r/min离心5min,取固体层以下脂质层,重复此步骤3~5次。合并所有脂质层溶液于已恒重好的离心管中,于80℃水浴蒸干溶剂,放入40℃烘箱中过夜干燥至恒重,计算脂质含量。1.5处理数据用统计软件GraphPadPrism5的单因素方差分析(ANOVA)中的Dounnett多重比较进行数据差异性分析。2结果与分析2.1p.trcornutum的脂质含量图1是尼罗红染色后检测到的5株藻的荧光强度,4株小球藻都只有很微弱的荧光强度(2.50~5.13)。三角褐指藻P.tricornutum产生的荧光强度达到51.68,是4株小球藻荧光强度的10倍以上。通过称重法测定P.tricornutum的脂质含量为17.4%,4株小球藻的脂质含量在14%~19%内,与P.tricornutum脂质含量相差不大。这种溶剂提取称重法与尼罗红染色荧光强度的巨大差别,与Chen等的研究结果一致,可以认为尼罗红染色法的有效性和微藻的分类及结构有关系。P.tricornutum属于褐藻纲,胞内脂质与尼罗红能够较好结合,而属于绿藻纲的4株小球藻则可能由于尼罗红染料不能与细胞中的脂质有效结合而导致发射的荧光强度较低。可见同一染色条件下不同藻种的荧光强度并不能作为脂质含量的指示。2.2采用尼罗红染色法测定小球藻脂质法的优化2.2.1不同浓度甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮的络合萃取对藻细胞的预处理的影响传统尼罗红染色法不能有效测定小球藻中的脂质含量,如果能找到一种处理方法来影响细胞壁和质膜的完整性以促进尼罗红染料与脂质的结合,从而发射出较强的荧光强度。取培养至对数生长期后期的藻液适量,8000r/min离心5min,去除上清,藻细胞沉淀用PBS洗两次,分别采用20%的甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、二甲基亚砜水溶液,水以及PBS缓冲溶液,重悬藻细胞至OD540值0.8,35℃水浴20min,按1mL藻液加15μL尼罗红染料(质量浓度为0.1mg/mL丙酮溶液),混匀染色5min,激发波长480nm,测定其在575nm波长的荧光强度,结果见图2。图2显示,与水和PBS缓冲液相比,20%的甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮的处理并没有增加藻的荧光强度,而20%的二甲基亚砜(DMSO)对藻的预处理得到了较高的荧光强度。DMSO能够改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性,促进了尼罗红染料进入藻细胞。因此,选择20%的DMSO水溶液重悬藻细胞进行预处理。2.2.2dmso体积分数对染色的影响取培养至对数生长期后期的藻液适量,8000r/min离心5min,去除上清,藻细胞沉淀用PBS洗两次,分别采用不同体积分数的DMSO(0、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%)水溶液重悬藻细胞,使藻液OD540值0.8,40℃水浴20min,按1mL藻液加15μL尼罗红染料(质量浓度为0.1mg/mL丙酮溶液),混匀染色5min,激发波长480nm,测定其在575nm波长的荧光强度,考察DMSO体积分数对染色的影响,结果见图3。2.2.3预处理温度对染色的影响按2.2.2方法,采用20%DMSO水溶液预处理,分别在不同温度下(20、30、35、40、45、50、55、60℃)水浴20min,考察预处理温度对染色的影响,结果见图4。2.2.4尼罗红染料用量的确定按2.2.2方法,采用20%DMSO水溶液稀释藻液,在40℃水浴20min,按1mL藻液加入不同体积质量浓度为0.1mg/mL的尼罗红染料丙酮溶液,考察不同尼罗红染料用量对染色的影响,结果见图5。图5显示,尼罗红染料用量在5~15μL之间时,4株小球藻的荧光强度均随尼罗红染料用量的增加而逐渐增强,在15μL时达到最大,超过15μL时荧光强度逐渐减弱。2.2.5藻细胞密度对染色的影响取对数生长期后期藻细胞用20%DMSO水溶液按不同比例稀释,得到一系列细胞密度不同的藻液(以OD540表征),然后40℃水浴20min,按1mL藻液加15μL尼罗红染料(质量浓度0.1mg/mL丙酮溶液),混匀染色5min,激发波长480nm,测定其在575nm波长的荧光强度,考察藻细胞密度对染色的影响,结果见图6。2.3尼罗红染色法的荧光强度与重复性对比图7是对4株小球藻分别用传统尼罗红染色法,改进的尼罗红染色法和称重法进行测定的结果。与传统尼罗红染色法相比,改进的尼罗红染色法的荧光强度显著增强(p<0.01),重复性也很好。说明改进的尼罗红染色法可以实现厚壁小球藻的染色,更为准确地反映胞内脂质含量,可以用作绿藻脂质含量的快速筛选。3尼罗红染色法针对一些小球藻的尼罗红不易染色的问题,选取4株小球藻为材料,通过物理和化学的预处理,提高了尼罗红染色的有效性。优化的小球藻细胞脂质尼罗红活体染色的条件为:使用20%的DMSO作为渗透剂,在水浴温度35~40℃下对OD540值为0.8~1.1的藻液进行预处理,然后以1mL藻液用15μL质量浓度为0.1mg/mL的尼罗红丙酮溶液进行染色。改进的尼罗红染色法加强了尼罗红染料与小球藻脂质的结合,所发射的荧光强度较好地反映了小球藻细胞脂质的含量。与传统的称重法比较,该方法具有原料需求少、效率高、低能耗的特点,可以作为筛选高脂质含量绿藻的快速检测方法。图3显示,当用体积分数为20%的DMSO处理4株小球藻时,均出现最大荧光强度。因此,后续实验均采用体积分数20%的DMSO水溶液预处理