流加培养对小球藻生长的影响

流加培养对小球藻生长的影响

小球藻是绿藻门的一种细胞藻类。它含有许多营养成分，如糖、养分、脂肪酸等。具有多种保健和药理作用。小球藻糖具有抗肿胀、抗毒、抗血郁、增强身体免疫功能等作用。通过处理和破壁处理后，小球藻可以直接生产小型浮藻片、小球藻粒或小球藻胶囊。它适用于预防和辅助治疗高血压、高血糖、动脉硬化、冠状动脉粥样硬化、冠状动脉粥样硬化、冠状动脉粥样硬化、冠状动脉粥样硬化、冠状动脉粥样硬化、冠状动脉粥样硬化、冠状动脉粥样硬化、慢性溃疡、免疫功能低等疾病。它也可以用来开发具有更高成本的精细化工产品和药物产品，如生产绿叶、橘氨酸、油脂等。该药物产品的提取可以提取到医药产品中。此外，小球藻也可以用于环保处理。与人形成一个循环系统。人们称出的co可用于小球藻的生长，而从小球藻产生的o2可用于人体呼吸。小球藻在航空航天中具有重要的开发价值。要更好地利用小球藻,首先要获得大量的小球藻藻体,本研究通过优化小球藻培养条件来提高小球藻生物量,为其进一步的扩大培养提供依据.1材料和方法1.1藻类和机器1.1.1藻类的来源小球藻(Chlorellaspp)藻种由烟台大学海洋生化研究所提供.1.1.2仪器HZQ-QG振荡箱(哈尔滨东联电子技术开发有限公司);LDZX-40BI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂).1.2小球藻的生长1.2.3生物量的测定用血球计数板计数.1.2.4实验用培养基在f/2培养基基础上进行优化.1.2.5土壤浸出液的制备首先取没有施化肥或农药的土壤在三角瓶(1L)底部铺上1cm厚的土层,随后加入1L蒸馏水,高压灭菌30min后,静置24h,倾出上清液即可使用.1.2.6培养条件23℃,光强为4.5×103lx,转速为140r/min下培养1.2.7正交试验优化小球藻培养盐小球藻生长所需要的营养元素有15～20种,天然水体的大多数元素都能满足它的需要,不会成为限制性因子.C、N、P是小球藻生长的主要营养元素.小球藻营光自养生长,可直接利用空气中的CO2.CO2主要以HCO3-的形式被利用.因此HCO3-盐可直接作为小球藻生长的碳源ue001.氮是生物最重要的营养成分,而硝酸盐一直是培养小球藻的一种普通氮源.培养基的pH是影响藻类有关生长代谢等许多生理过程的另一重要因子.本实验利用正交试验优化培养基中NaHCO3、NaNO3和KH2PO4的浓度及小球藻生长适宜的pH,采用L9(34)正交表进行四因素三水平正交实验。如表1所示.2结果与讨论2.1氮源和磷源水平对小球藻生长量的影响按表1设计的因素水平在光照培养箱中培养,结果如表2所示.由表2可知,第5组实验小球藻长势最好,且当pH值在6～7之间时小球藻生长情况较好,pH值为5时,小球藻的生长明显较差;当碳酸氢钠浓度小于0.10g/L时,小球藻生物量随碳酸氢钠浓度的增加而增加,但超过0.10g/L时,小球藻的生物量又随之下降;随着氮源水平的升高小球藻生长量逐步升高,说明氮源水平取得不够,需作进一步实验;小球藻生长量随磷源水平的升高而逐步下降,说明磷源水平取得过高,应取较低的水平继续实验.总之,通过分析可知,较好的水平组合为A2B2C3D1,比较四因素的极差R知,影响小球藻生长的因素的主次顺序为A>C>D>B,说明pH值对它的影响最大,其次是氮源浓度.为了对氮源和磷源水平作进一步的探索,设计实验如表3所示,结果见表4.由表4可知,小球藻的生物量随NaNO3浓度的增加而下降,故培养基中NaNO3最适浓度为0.225g/L;小球藻的生物量随KH2PO4浓度的减少而下降,故培养基中KH2PO4最适浓度为0.005g/L.小球藻能利用光合作用将二氧化碳、水和无机盐转化为有机物.二氧化碳主要以HCO3-形式被利用,pH是影响培养基中HCO3-在总溶解状态的CO2所占比例的主要因素,此外,pH值也会影响光合作用,并影响培养基中藻细胞对离子的吸收和利用,以及代谢产物的产生.因此,pH是影响小球藻生长的重要因素,与正交试验的结果相符.2.2维生素的添加量对小球藻生物量的影响维生素是最早发现的生长因子,它们在小球藻生长过程中所起的作用主要是作为酶的辅基或辅酶参与新陈代谢.在已优化好营养盐和pH值的培养基的基础上,设计单因素实验考察维生素需求量.在配好的培养基中按体积分数添加混合维生素量0.10%、0.13%、0.16%、0.20%,在光照培养箱中培养,结果如图1所示.由图1可见,小球藻的生物量先是随着维生素添加量的增加而增加,当维生素添加量超过0.16%时,小球藻的生物量反而会下降,由此可知,培养基中维生素的添加量以0.13%～0.16%为宜.2.3光合对小球藻细胞生长的影响小球藻进行自养生长时会利用CO2放出O2,培养基中通入大量的无菌空气既可为活细胞提供碳源,而且会把抑制藻细胞生长的O2排出,同时又有助于保持藻细胞处于悬浮状态并促进营养物质运送到细胞表面.但通气量过大可能会损伤或杀死一些敏感细胞,应保持较小的通气量,并且通气管道和过滤器都需无菌.培养条件:500mL培养基中添加1.5×106/mL的藻种于4.5×103lx下培养14d,通气量水平取为:0,0.5,1.0,1.5,2L/min,结果如图2所示.从图2可以看出,小球藻在通气量为1.5mL/min时,生物量最大.当光照到培养液表面时,藻体本身对光有遮挡作用,故入射光穿透培养液时存在着不断衰减的现象,且随着培养密度的增加,这种光衰减现象会不断加重,因此增加通气量会加强培养液的混合,使小球藻每一个细胞接受光照的机会均等.但过强的通气使之对细胞的剪切力加大,反而不利于小球藻的生长.2.4光饱和效应实验对于营光合自养生活的小球藻而言,光是藻生长的重要限制因素.当温度和营养不限制其生长时,光就成为影响小球藻自养生长的主要因素,即藻的生物量是光照的函数.一般情况下,在一定光照范围内藻的光合作用效率会随光照度的增加而增加,但光照度达到一定值时,光合作用效率几乎保持在一定水平,不再增加,这种现象称为光饱和效应.如果光照度超过光饱和点一定限度后,藻的光合作用效率将会下降,导致细胞生长缓慢甚至死亡,即光抑制现象.在光饱和点以下的光照度是藻生长的一个限制性因子ue001.光强取2.0×103,3.3×103,4.5×103,5.5×103lx进行单因素实验,结果如图3所示.由图3可看出,光强为4.5×103lx时小球藻生长最好.光合作用由光反应和暗反应两个过程组成,当暗反应所需的中间产物不能从光反应中得到充分满足时,整个过程的速率完全取决于光反应的速率,即随着光强的增加光合作用加强,小球藻的生长较快;若光反应形成了大量中间产物,而暗反应速率已配合不上光反应的速率,此时光合作用的整体速率将只取决于暗反应的大小,同时由于光照强度太强,会导致光合色素的光氧化和细胞中的某些酶受到氧化伤害而使光合作用速率下降,因而存在一个适宜的光照强度.2.5尿素用量对小球藻生长的影响氮是生物最重要的营养成分,硝酸盐一直是培养小球藻的一种普通氮源,但在实验过程中发现,由于硝酸盐的消耗会使培养基的pH变化较大.有研究表明,在藻类的生长过程中消耗等量的氮,以尿素作氮源则比硝酸盐产生出较多的生物量,并引起培养基较小的pH之变化,因此添加尿素作为有机氮源考查其对小球藻生长的影响.尿素浓度取为0,0.30,0.60,0.90g/L,在光照培养箱中培养,结果如图4所示.实验发现尿素是一种很好的有机氮源,并且在小球藻的培养过程中,培养基中pH一直非常稳定,当尿素浓度为0.30g/L时小球藻生长最好,而浓度为0.90g/L时则明显不如对照组长得好,说明氮源量如果太多反而会抑制小球藻的生长.2.6土壤浸出液对小球藻生长量的影响土壤浸出液往往含有一些含碳,氮,磷的有机物,无机盐和微量元素。这些成分有可能成为小球藻生长所需要的营养成分.在将营养盐及pH优化好了的培养基中加入体积分数分别为:0,0.2%,0.4%,0.6%的土壤浸出液,在光照培养箱中培养,结果如图5所示.由图5可看出,添加土壤浸出液后,小球藻的生长量明显高于未添加的,且添加量在0.4%为最好.3小球藻培养基的配方确定pH是影响小球藻生长的重要因素.光照强度和通气量通过影响小球藻光合作用强度而影响小球藻的生长.小