橡实象虫线粒体co基因序列的克隆与序列分析

橡实象虫线粒体co基因序列的克隆与序列分析

分布在中国蚕业区的橡胶病虫害有290多种，分为7个项目和47科。其中，鞘刀是第二个蚕科昆虫。橡实象虫(Curculioarakawai)是鞘翅目(Coleoptera)象甲科(Curculionida)危害柞树种子(橡实)和嫩芽的主要害虫。目前对柞树害虫的分类与鉴定仍依靠传统的形态特征分析手段,受季节气候的影响,有些害虫的分类鉴定必须通过人工饲养到特定虫态才能进行,其效率低,准确度也不高。对害虫进行快速而准确的分类鉴定是深入开展行为学、生态学、生理学以及害虫综合治理等相关研究的基础和前提。20世纪90年代,随着PCR技术的日趋完善和分子生物技术的快速发展,以线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cytochromeCoxidasesubunitⅠ,COⅠ)为主要标记基因的DNA条形码技术应运而生,即利用COⅠ基因5′端长500～650bp的碱基序列作为标记来实现物种的快速、准确鉴定与分类。线粒体DNA(mtDNA)是目前昆虫遗传多样性和系统进化研究重要的分子标记之一,具有进化速率较核DNA快,遗传过程不发生基因重组、倒位、易位等突变,组成稳定,严格遵守母系遗传等特点。COⅠ基因是线粒体DNA中重要的蛋白编码基因,由于COⅠ基因5′端500～700bp具有保守性强、碱基变异丰富等特点,所以成为目前DNA条形编码的主要目标基因。昆虫线粒体DNA不同基因的进化速率不同,包含的生物信息以及在分子系统进化和物种鉴定中的意义也不尽相同。本课题组已对橡实象虫等象甲科昆虫COⅡ基因的分子进化规律和碱基多样性进行分析,结果表明该基因序列碱基多样性丰富,能很好反映各物种间的进化关系。本研究克隆橡实象虫COⅠ基因500～650bp序列片段,并对橡实象虫COⅠ基因片段和其它24种昆虫同源序列的碱基多样性及系统进化关系进行分析,旨在通过DNA条形码数据快速、准确识别橡实象虫,为深入研究害虫的行为学、生理生态学乃至害虫的综合治理奠定理论基础。1材料和方法1.1dna提取所需试剂2010年9月末,于沈阳农业大学柞蚕科研基地(沈阳东陵)的辽东栎蚕场收集辽东栎种子(橡实)中脱出的橡实象虫幼虫,于-20℃冷冻保存。DNA提取所需试剂、MightyAmpDNA聚合酶、2×MightyAmpDNAbuffer(包含Mg2+、dNTP)、克隆测序试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司;PCR产物回收试剂盒OmegaAgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.0购自Omega公司。1.2pcr扩增作用取橡实象虫老龄幼虫3头,参照文献的方法分别提取基因组DNA。目的基因片段的PCR扩增引物为COⅠ-F(5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)和COⅠ-R(5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′)。PCR扩增反应体系(25μL):模板DNA1μL,2×MightyAmpDNAbuffer12.5μL,20μmol/L上、下游引物各0.5μL,5U/μLMightyAmpDNA聚合酶0.5μL,ddH2O10μL。扩增反应程序:98℃预变性2min,98℃10s;98℃变性10s,60℃退火15s,68℃延伸1min,共30个循环;68℃延伸10min后4℃保存。PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳定性检测。1.3菌株细胞培养将PCR扩增产物切胶回收纯化,使用DNALigationKit中的SolutionⅠ将纯化产物与pMD18-TSimpleVector连接,转化至大肠杆菌(E.coli)JM109感受态细胞中,涂布平板,37℃过夜培养。挑选阳性菌落植菌,提取重组质粒,分别使用通用引物BcaBESTPrimerRV-M和BcaBESTPrimerM13-47进行测序。1.4基于co基因片段片段的活性树构建p-Distance)等。碱基偏倚度(skewness)分析根据文献的方法进行,其中AT偏倚度=(A-T)(A+T),GC偏倚度=(G-C)(G+C)。采用MEGA3.0软件包中的非加权组平均法(unweightedpair-groupmethodwitharithmeticmeans,UPMGA)、邻接法(neighbor-joining,NJ)和最大简约法(maximumparsimony,MP),利用Kimura2-parameter模型构建橡实象虫与其它24种昆虫基于COⅠ基因片段序列的系统发生树,并重复抽样1000次进行Bootstrap检验,其余选项为默认。若转换与颠换(Ts/Tv)的比值(R)<2.0时,认为该基因序列发生的突变已经达到饱和,进化受噪音的影响较大,在构建系统发育树时还需要进行特别加权。2结果与分析2.1co基因片段的鉴定以引物COⅠ-F/COⅠ-R对橡实象虫基因组DNA进行PCR扩增,3个样本的扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测,均在800～1000bp之间出现一条大小相同的特异性条带(图1),与预期结果相符。回收、纯化后测序,将两端的引物序列及不稳定序列剪切掉,得到长556bp的COⅠ基因片段。将该片段序列在GenBank进行BLAST搜索,结果同比对的象甲科中Kyklioacallesreginae(GenBank登录号:GU981495)等昆虫的COⅠ基因序列有极高的相似度,证明所得序列为橡实象虫的COⅠ基因片段序列。将橡实象虫3个样本的COⅠ基因片段序列提交GenBank,登录号分别为JN258957、JN258958、JN258959。2.2同源co基因片段序列的a、t、c、g分析结果将获得的橡实象虫COⅠ基因片段序列于GenBank中进行BLAST搜索,得到了包括鞘翅目、鳞翅目和双翅目昆虫的102条同源序列,其中包括40条未知种记录(38条记录鉴定到目,2条记录鉴定到属)和62条已知种记录,对这62条已知种和2条已知属的记录序列进行整理,共归属于24种昆虫。对包括橡实象虫在内的25种昆虫的31条线粒体COⅠ基因序列的碱基组成特点进行分析,结果见表1。这些COⅠ基因同源序列中,A、T、C、G4种碱基的平均含量分别为31.3%、38.6%、16.3%和13.8%,A+T的含量为69.9%,明显高于G+C的含量(30.1%)。所有同源COⅠ基因片段序列密码子第1位点的A、T、C、G平均含量分别为38.1%、33.6%、11.4%、16.9%,第2位点的A、T、C、G平均含量分别为21.1%、37.4%、22.5%、19.0%,第3位点的A、T、C、G平均含量分别为34.7%、44.5%、15.3%、5.5%。本实验得到的橡实象虫3个样本的COⅠ基因片段序列中,A、T、C、G4种碱基的平均含量分别为32.3%、37.5%、16.6%和13.6%,4种碱基在密码子第1位点的平均含量分别为38.6%、34.0%、10.8%、16.6%,在第2位点的平均含量分别为23.2%、36.8%、22.7%、17.3%,在第3位点的平均含量分别为35.1%、41.5%、16.4%、7.0%,此外,整个序列中的A+T含量为69.8%,明显高于G+C的含量(30.2%)。将橡实象虫等所有昆虫样本COⅠ片段序列对齐后,基因序列间没有检测到核苷酸的插入或缺失现象,无终止密码子和移码突变,氨基酸的编码从第2位碱基开始,长度为556bp的基因序列共编码185个氨基酸。从碱基使用偏好性来看,橡实象虫及其它24种昆虫的COⅠ基因序列显著偏好使用碱基T(AT偏倚度平均为-0.1048)。其中:鞘翅目昆虫COⅠ基因序列中,碱基T含量最低,平均为37.4%(AT偏倚度平均为-0.0959);其次是双翅目昆虫的COⅠ基因序列,碱基T的含量平均为38.8%(AT偏倚度为-0.1214);鳞翅目昆虫COⅠ基因序列中的碱基T含量最高,平均为40%(AT偏倚度为-0.1112)。2.3co基因序列的稳定性和基因组织利用MEGA3.0分析橡实象虫及其它24种昆虫COⅠ基因的平均遗传距离为19.7%。橡实象虫3个样本间的COⅠ基因序列碱基差异数为0～2个,遗传距离在0～0.4%之间。橡实象虫与鳞翅目丝角蝶科Macrosomasp.属间的COⅠ基因序列的遗传距离最大,为20.1%,碱基差异数为111个;与鞘翅目象甲科Kyklioacallespunctaticollis间的COⅠ基因序列的遗传距离最小,为17.2%,碱基差异数为95个。种间遗传距离最大的发生在鞘翅目象甲科的Ceutorhynchusrapae与鳞翅目灰蝶科的Pseudoluciacollina、Pseudoluciavera之间,COⅠ基因序列的遗传距离均为23.4%,碱基差异数为129个;种间遗传距离最小的发生在鳞翅目灰蝶科的Theclinesthesmiskini和Theclinestheshesperia之间,Pseudoluciavera和Pseudoluciacollina之间,COⅠ基因序列的遗传距离均为0.4%,碱基差异数为4个。橡实象虫及其它24种昆虫的COⅠ基因序列碱基替换模式中,颠换(transversion,Tv)明显高于转换(transition,Ts),如表2所示,R值为0.7。碱基颠换主要发生在T←→A间,占颠换碱基总数的75.9%,依次是A←→C(13.8%)、T←→G(6.9%)、C←→G(3.4%);转换主要发生在T←→C间,占转换碱基总数的71.8%,A←→G间的转换占28.2%。如表3所示,在橡实象虫及其它24种昆虫的COⅠ基因长556bp的序列中,共检测到变异性位点(variablesites)268个,变异率为48.2%,其中简约信息位点(parsimony-informativesites)229个,单突变位点(singletonsites)39个。密码子第2位点的碱基保守性最强,其次是第1位点,第3位点的碱基变异性最强,占变异碱基总数的42.9%。以橡实象虫及其它24种昆虫COⅠ基因两两间遗传距离(p-Distance)为横坐标,碱基替换数为纵坐标建立碱基替换饱和度分析趋势图(图2),COⅠ基因序列的碱基转换数和颠换数随着种间基因遗传距离的增大都呈明显的线性上升趋势,表明橡实象虫及其它24种昆虫的COⅠ基因存在较大进化潜能。2.4不同位点分布的差异位点分布序列可变性位点滑动窗口分析见图3,在橡实象虫及其它24种昆虫的COⅠ基因长556bp的序列中,差异位点在整个区段内均有分布,且分布密度差别不大,可变性位点数随滑动窗口的移动变化较平缓,没有明显的升降趋势。碱基可变性位点数多集中在序列的中部区域,5′端和3′端2个端部区域的可变性位点较少,210～420bp范围内可变性位点最多。2.5橡实象虫与nh-pcr的亲缘关系利用NJ、ME和MP法构建橡实象虫及其它24种昆虫基于COⅠ基因序列的分子系统进化树,如图4所示,3种方法构建的分子系统进化树均分为2个明显的分支:鞘翅目象甲科的所有物种聚集在一起单独形成一个分支;鳞翅目、双翅目和鞘翅目隐翅虫科的Athetapervagata、天牛科的Desisavariabilis聚在一起形成另外一个分支。在前一个分支中,橡实象虫与Kyklioacalles属的各个物种亲缘关系最近;在后一个分支中,天牛科的Desisavariabilis与其它物种的进化关系最远,单独形成一个亚支,其它物种聚在一起形成另外一个亚支,该亚支又形成2簇,鳞翅目昆虫聚在一起形成一簇,双翅目昆虫和隐翅虫科聚在一起形成另一簇。3co基因片段分析线粒体DNA在不同昆虫类群中表现出不同的碱基替换规律。本研究中,橡实象虫COⅠ基因的碱基替换模式中颠换明显高于转换,与橡实象虫及其近缘种COⅡ基因的碱基替换模式中颠换明显高于转换的结果相符。而诸立新等对鳞翅目凤蝶科(Papilionidae)的COⅠ和COⅡ基因序列特点的研究发现,其碱基颠换均低于转换。对鳞翅目草螟科(Crambidae)秆野螟属(Ostrinia)昆虫的COⅡ基因序列特点分析发现其碱基替换模式同样是颠换低于转换,与本研究中碱基替换模式相反。本课题组之前分析橡实象虫及其近缘种的线粒体DNACOⅡ基因的进化速率为39.7%,本研究中鞘翅目象甲科昆虫的COⅠ基因的进化速率为40.2%,符合Hebert等得出的COⅠ和COⅡ基因进化速率基本一致的观点。本研究中橡实象虫COⅠ基因碱基A+T含量明显高于G+C含量,碱基使用明显偏向于T,橡实象虫等昆虫样本COⅠ基因序列的密码子第2位点核苷酸进化速率最慢,碱基保守性最强,其次是第1位点,第3位点的碱基变异性最强,核苷酸进化最快与本课题组之前的研究结果完全一致。利用DNA条形码鉴定的物种63.7%来自昆虫,其中研究较多的是鳞翅目,其次为双翅目、鞘翅目等。Hebert等对昆虫线粒体基因序列进行了分析,结果表明,同属各种的COⅠ基因序列的平均差异程度(距离)为11.3%,而种内的序列差异程度低于2%。本研究分析橡实象虫及其它24种昆虫的COⅠ基因片段序列的平均差异程度为19.7%,绝大多数昆虫能根据COⅠ基因片段区分开,而鳞翅目灰蝶科Theclinestheshesperia和Theclinesthesmiskini、Pseudoluciavera和Ps