胶体金偶联虾过敏反应的研制

胶体金偶联虾过敏反应的研制

食物过敏是一种常见和复杂的过敏性疾病，其发病率日益增加，对人们的生活和健康产生了重大影响。虾是最优质的动物蛋白来源之一,也是八大类容易引起过敏的食物之一。而淡水小龙虾又是我国淡水虾类中的重要资源,广泛分布于长江中下游地区,是餐饮业中的热门菜肴之一,具有很大的过敏潜能。因此,建立可靠、快速的淡水虾过敏原检测方法,避免接触该过敏原,具有很重要的现实意义,也是预防和治疗淡水虾食物过敏的关键。胶体金免疫层析技术(gold-immunochromatographyassay,GICA)是20世纪80年代发展起来的一项以胶体金作为示踪物的免疫分析技术,具有简便快速、费用低、易于操作等特点,因此在诊断领域得到广泛应用。本研究立足于研制虾过敏原胶体金检测试纸条,快速检测食品中的虾过敏原,从而提高过敏患者的生活质量。1材料和方法1.1羊抗鼠igg胶体金(批号:G1527)购自Sigma公司;重组原肌球蛋白虾;羊抗鼠IgG(批号:BeijingA46)购自华美生物公司;硝酸纤维素膜(批号:HATF00010)、玻璃纤维素膜(批号:APFF02500)均购自美国Millipore公司。1.2方法1.2.1特殊感染型免疫组化免疫法将纯化的原肌球蛋白稀释成蛋白含量2mg/ml,跟弗氏完全佐剂1∶1(V/V)用注射器乳化。取雌性新西兰大白兔2只,皮下免疫4点(腹股沟两侧各一点,背部皮下两点)。第一次免疫量为1mg/只。第二次加强免疫起用弗氏不完全佐剂,每隔21d免疫一次。第二次免疫剂量为1.5mg/只,第三次至第五次免疫量均为2mg/只。从第二次免疫开始,每次免疫后10d,耳缘静脉取血,分离血清,ELISA测效价。第五次免疫10d后,将兔子颈动脉放血致死,收集血清,检测效价(达到1∶2,000,000),分装,冻存。1.2.2小鼠骨髓细胞系统的制备将纯化的原肌球蛋白稀释成蛋白含量2mg/ml,跟弗氏完全佐剂1∶1(V/V)用注射器乳化。取雌性6周龄~8周龄BALB/c小鼠8只,第一次用弗氏完全佐剂,100mg/只,皮下注射免疫。二次加强免疫起用弗氏不完全佐剂,每隔14d免疫一次,第二次免疫剂量为100mg/只,第三次为150mg/只。三免14d后,用PBS冲击免疫(融合前3d),腹腔注射,200mg/只。在第二次免疫和第三次免疫后7d,分别断尾采血,分离血清,ELISA测效价(第三次免疫后,达到1∶20,000)。选取效价高的小鼠,取脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0融合,筛选单克隆细胞。对筛选到的克隆细胞进行放大、冻存、复苏,多次克隆试验,以检验细胞株的稳定性。取10只BALB/c10周龄以上的母鼠,每只注射降植烷0.5ml,一周后注射杂交瘤细胞0.5ml,2×106个细胞,一周后处死小鼠,抽取腹水,离心去脂后冻存。1.2.3蛋白/纯度检测取5ml血清或腹水,4℃解冻。用62mlPBS稀释,搅拌混匀。逐滴加入33ml饱和硫酸铵溶液,搅拌30min。4℃静置3h。4℃,14000r/min离心10min,收集沉淀。用50mlPBS重新溶解。重复过proteinA柱4次。平衡后用0.1mol/L甘氨酸(pH=2.8)洗脱,1ml×10管。SDS电泳,推测各管蛋白含量及纯度。收集第2~6号管,用1×PBS透析,换液3次。收集透析后的溶液,测定蛋白浓度,-20℃冻存备用。1.2.4核心标记的测定将单抗溶液置入透析袋中,按1∶1000的比例,加入10mmol/LTris-HCl缓冲液(pH=8.0),透析过夜,除去溶液内盐和甘油等影响标记的物质。1.2.5kco3混合规则取6个1.5ml离心管,分别加入1ml胶体金,然后依次加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml0.2mol/L的K2CO3溶液,混匀。再分别加入20ml1mg/ml的单抗,混合均匀。静置15min后,各加入200ml10%NaCl溶液,混合均匀。静置15min后观察颜色变化。1.2.6单抗加入量的确定取8个1.5ml离心管,分别加入lml胶体金,再各加适量0.2mol/LK2CO3溶液调至最适pH。混合均匀后,依次加入6ml、8ml、10ml、12ml、14ml、16ml、18ml、20ml1mg/ml单抗,再次混匀。静置15min后,分别加入200ml10%NaCI溶液,混合均匀。静置15min后观察颜色变化。1.2.7单抗加入量的确定取5个1.5ml离心管,加入1ml胶体金。每管各加适量0.2mol/LK2CO3溶液调至最适pH,混匀。再加入一定量的单抗,达到最佳标记浓度,混匀,静置15min。依次加入0.1%、0.25%、0.5%、0.75%、1%BSA,混匀,静置15min。4℃,10000r/min离心15min。观察各管胶体金挂壁及沉淀状况,比对封闭效果。1.2.8带模带+组合垫+pvc衬板的安装试纸条由PVC衬板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫组成。用点膜仪在结合垫上喷涂单抗-胶体金偶联物(25ml/cm);在硝酸纤维素膜上按照1ml/cm的量喷涂1.0mg/ml过敏原多抗和1.0mg/ml的羊抗鼠IgG,分别作为检测线和质控线。依次将硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫,吸收垫粘贴于PVC衬板上。其中,结合垫、吸收垫均与硝酸纤维素膜有2mm重叠,样品垫部分层叠于结合垫上,二者重叠约4mm。然后,切割成4mm宽的试纸条,置于密封袋中,加干燥剂,密封,4℃保存。1.2.9离心-氮吹法选取淡水小龙虾、日本沼虾、虾蛄、河鲫鱼、带鱼、猪肉、牛肉等样品,各称取3g,绞碎,置于50ml离心管中;加入9ml乙腈-水溶液,振荡混匀10min;4000r/min离心10min;取3ml上清液,移至另一洁净的离心管中。加入2ml2mol/L的NaCl溶液和7ml乙酸乙酯,振荡混匀10min,4000r/min离心5min;将上层液体转至另一离心管中,50℃下用氮吹仪吹干;加入1ml0.02mol/LPB缓冲液和1ml正己烷,振荡混匀1min;4000r/min离心5min;去除上层液,取100ml下层液体用于分析。每种样品提取液检测8次以上。1.2.1样品处理与生化使用超速离心法,提取淡水小龙虾总蛋白。具体操作步骤如下(整个操作过程在冰上进行):取淡水小龙虾1只,Milli-Q洗净,去内脏,挑取虾肉,在液氮中用研钵将虾肉研磨成粉。加入15倍体积-20℃预冷丙酮重悬虾肉粉沫,-20℃静置,期间隔1h搅拌1次,每3h换1次丙酮,换3次~4次,直至脱脂、脱色完全。冷冻干燥抽净丙酮,称重。按1∶4重量体积比(g/ml)加样品提取液(8mol/L尿素,4%(W/V)CHAPS,60mmol/LDTT)充分混匀,蜗旋30s。4℃,5000r/min离心10min,小心避开上层漂浮的脂质层,吸取中间澄清部分的液体,上清用Bradford法定量总蛋白浓度,然后进行梯度稀释,使终浓度依次为0ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml。分别取100ml稀释液用于分析,每个浓度检测8次以上。1.2.1胶体金-产品免疫c将待测残留物溶液(样品提取物溶液)滴加到样品垫上后,溶液将朝着吸收垫方向移动,当移动至结合垫时,结合垫上的胶体金-过敏原单抗偶联物溶于溶液中。如果样品中含有该过敏原,则过敏原与单抗结合,形成胶体金-过敏原单抗-过敏原三联复合物。当到达检测线时,再次与固定在检测线上的过敏原多抗相结合,从而被固定在检测带上,形成红色信号带。没有与检测线上过敏原多抗结合的胶体金复合物到达质控线时,被质控线上的二抗捕获。因此,阳性检测有两条带;阴性检测只有质控线一条带。若质控线没有出现,则检测结果无效。2结果2.1单过敏试验2.1.1胶体金稳定性测定如表1所示,前两号样品在加入NaCl后颜色变为灰色或紫色,说明这时胶体金是不稳定的,发生了团聚。3号样品之后的胶体金依旧保持红色,很稳定的。一般情况下应调至略偏碱性。因此,标记最适pH选择1ml胶体金加4ml0.2mol/LK2CO3溶液。2.1.2变紫、第四管不同蛋白浓度条件下,各管颜色变化见表2。前三管颜色均变紫,第四管以后较稳定,依旧保持红色。最小蛋白稳定量的基础上再加20%,即为标记所需的最适蛋白量。因此,标记此单抗的最适蛋白浓度应为14.4mg/ml。2.1.3胶体金挂壁现象如图1所示,在0.1%和0.25%BSA封闭条件下,均有胶体金挂壁现象。其中0.1%BSA封闭时挂壁最为严重,0.25%BSA封闭时有极轻微挂壁。因此,选用0.5%BSA封闭。2.2虾蛋白饮料的免疫检测结合垫上喷金标过敏原单抗复合物原液,检测线(T线)分别喷同样浓度的过敏原单抗和多抗。以400ng/ml的虾蛋白稀释溶液作为阳性检测样本,不含虾蛋白的稀释液作为阴性检测样本,比对包被效果。结果表明,阴性检测均无假阳;阳性样本检测,T线包被虾过敏原多抗,信号带更亮(图2)。2.3结合垫上喷金标单产品液和2倍稀释后的金标混合物扫查面为零将金标单抗原液,用20mmol/LTris-HCl(pH=8.0)+20%蔗糖稀释0倍、2倍、4倍、8倍,依次喷到结合垫上。检测线按1μl/cm的量喷1.0mg/ml过敏原多抗;质控线上喷1.0mg/ml的羊抗鼠IgG。检测结果显示,结合垫上喷金标单抗原液和2倍稀释后的金标复合物,信号带亮度一致。金标单抗被4倍和8倍稀释后,信号带逐渐减弱。因此,后续实验均选用2倍稀释的金标单抗喷涂结合垫(图3)。2.4特异性实验2.5虾蛋白检测点蛋白浓度和检测线处信号带的变化以50ng/ml的淡水小龙虾蛋白稀释溶液和不含虾蛋白的稀释液为检测样本时,检测线处均无信号带。以100ng/ml的虾蛋白稀释溶液为检测样本时,检测线处有微弱信号带。蛋白浓度为200ng/ml和400ng/ml时,信号带逐渐增强。因此,此试纸条的灵敏度为100ng/ml(图5)。3虾过虾用胶体金免疫层析法检测虾产品食物过敏是危害人们身体健康的重大问题之一,给过敏患者的生活带来极大的不便。鉴于食物过敏尚无有效的治疗方法,快速准确的过敏原检测技术已经成为各国研究的焦点之一。目前常用的方法有PCR法、DNA探针原位杂交法、酶联免疫吸附试验检测及免疫杂交电泳等。但是,这些方法操作较为复杂,需要一定的试验仪器设备,且耗时较长,达不到现场快速检测的目的。胶体金免疫层析技术,具有简便快速、费用低、易于操作等特点,并有“浓缩的ELISA”之称,已经成为检疫、检测、诊断领域发展的一个新方向,目前应用范围不断扩大,试剂品种达百种,应用在疾病诊断、食品安全、动物疫病诊断等各个领域。本试验研制的虾过敏原快速检测试剂盒利用胶体金免疫层析法,标记淡水小龙虾过敏原单抗,包被虾过敏原多抗,特异性非常强。日本沼虾、虾蛄、河