十五章生物技术与作物育种市公开课获奖课件省名师优质课赛课一等奖课件

第十五章生物技术与作物育种1/61第一节细胞工程与作物育种植物细胞工程：是以植物组织和细胞培养技术为基础发展起来一门科学。它以细胞为单位，在体外（invitro）条件下进行培养、繁殖或人为地使细胞一些生物学特征按人们意愿生产某种物质过程。包含花药培养、体细胞变异筛选、幼胚培养、试管受精和原生质体融合等2/61理论基础：

细胞全能性（celltotipotency）。指细胞所含有形成各种细胞类型潜在能力。

因为细胞核内有保持物种遗传性所需要全套遗传物质所以高度分化体细胞含有发育成一个生物体能力。3/61一、植物细胞和组织培养技术（一）培养基及其组成1、培养基种类和特点（1）MS培养基（2）B5培养基（3）White培养基（4）N6培养基（5）KM-8p培养基（6）SH培养基4/612、培养基成份无机盐和水大量元素C.H.O.N.P.K.Ca.Mg.S.Cl微量元素Fe.Cu.Mo.Zn.Mn.Co.B.Na水蒸馏水、双蒸水或使用去离子水有机化合物糖碳源和能源氨基酸类有机氮源维生素类维生素b1(盐酸硫胺素)、维生素b6(盐酸砒哆醇)、生物素、烟酸、叶酸等生长调整物质生长素IAA、NAA、2,4-D、IBA细胞分裂素天然：6-BA、KT（激动素，糠基酰嘌呤）人工：ZT（玉米素）、2-iP赤霉素GA3成份不定物质椰乳、酵母提取物、番茄汁、香蕉泥琼脂从海藻中提取一个高分子碳水化合物5/613、培养基配置(1)水和药品水必须采取蒸馏水或无离子水，药品最好采取分析纯，最少是化学纯药品。(2)母液配置为方便培养基制备，现将培养基各种成份分类配成浓缩母液，正式配制时按要求用量稀释混合。(3)制备培养基

混合各成份母液熔化琼脂(4)培养基消毒主要有高温高压灭菌和过滤灭菌两种方法。调pH值分装灭菌放置备用搅拌混匀6/614、无菌操作方法（1）消毒剂消毒剂使用浓度（%）消除难易消毒时间（min）消毒效果次氯酸钠2易5~30很好次氯酸钙9~10易5~30很好过氧化氢10~12最易5~15好溴水1~2易2~10很好硝酸银1较难5~30好氯化汞0.1~1较难2~10最好抗生素4~50mg/L中30~60很好7/61（2）无菌操作（3）无菌培养二、细胞和组织培养与作物育种（一）体细胞克隆变异及其育种利用1、体细胞克隆变异遗传基础（1）染色体数目变异（2）染色体结构变异（3）点突变2、突变体筛选8/613、在作物改良上应用（1）抗病（2）抗除草剂（3）抗氨基酸或氨基酸类似物（4）耐盐（5）耐旱优良品种细胞培养R0R0群体改良体细胞克隆确定遗传方式遗传稳定性测试田间试验育种新品系多点田间试验区域试验继续田间试验、种子富集审定投入生产利用体细胞克隆变异技术路线9/61（二）单倍体细胞培养及育种利用1、单倍体细胞培养在遗传和育种中应用价值（1）后代快速纯合（2）提升选择效率（3）排除杂种优势对后代选择干扰（4）遗传研究良好试验材料体系（5）突变体筛选10/61母本X父本F1F2品系比较试验区域试验花药培养花药培养加倍选择判定杂交育种与单倍体育种周期比较11/612、离体培养条件下小孢子发育（1）营养细胞发育路径（2）生殖细胞发育路径（3）营养细胞和生殖细胞并进发育路径（4）花粉均等发育路径3、影响花药培养原因（1）供体植株生长条件（2）供体植株年纪（3）花粉发育时期（4）花蕾和花药处理（5）培养基（6）培养条件12/614、单倍体细胞培养与植物育种

A品种XB品种F1杂种单倍体培养重组纯合体重组了A和B品种优点纯系遗传稳定性测试新品系品种亲本推广利用杂种优势利用田间测试自交，田间测试确定遗传基础杂交和分离测试选择染色体加倍小孢子培养或花药培养13/61三、植物原生质体培养和体细胞杂交植物原生质体：指用特殊方法脱去细胞壁、裸露、有生活力原生质团。14/61（一）原生质体分离标准：确保原生质体不受伤害及不损害它再生能力，先决条件要有一个适当渗透压。1、分离方法（1）机械法（2）酶法15/612、影响原生质体分离原因（1）材料起源（2）渗透压（3）酶（4）分离培养基（5）培养条件（6）组织前处理3、原生质体搜集、纯化和活力测定16/61（二）原生质体培养（三）细胞融合（体细胞杂交）1、融合方法（1）NaNO3处理诱发融合（2）高pH-高浓度钙离子处理（3）PEG处理（4）电融合2、融合方式17/613、杂种细胞筛选（1）形态互补（2）遗传互补（3）代谢互补（4）生长互补4、杂种判定5、细胞融合与作物育种18/61第二节转基因技术与作物育种作物转基因育种：依据育种目标，从供体生物中分离目标基因，经DNA重组与遗传转化或直接运载进入受体作物，经过筛选取得稳定表示遗传工程体，在经过田间试验与大田选择育成转基因新品种或种质资源。19/61常规育种技术相比，转基因育种含有很大优势：

1.能够利用基因资源大大拓宽。2.为培育优良品种提供了崭新育种路径。3.能够对植物目标性状进行定向变异和定向选择。4.能够大大提升选择效率，加速育种进程。

20/61（一）作物转基因技术1、转基因技术发展现实状况（1）国际转基因植物研究与现实状况作物1996年1997年1997年/1996年大豆玉米烟草棉花油菜累计50301008012280510320160140120125010.210.71.61.8104.5全球转基因作物种植面积比较（单位：万公顷）21/61（2）我国转基因作物研究与利用概况转Bt基因抗虫棉对棉铃虫抗性表现22/61（二）转基因育种程序

目标基因或DNA获取含有目标基因或者DNA重组质粒构建受体材料选择和再生系统建立转基因方法确实定和外源基因转化转化体筛选和判定转基因植株育种利用23/611、目标基因取得（1）依据基因表示产物---蛋白进行基因克隆分离和纯化控制目标性状蛋白质或多态，进行氨基酸序列分析;依据所氨基酸序列推导对应核苷酸序列;采取化学合成方法合成该基因;经过对应功效判定来确定所推导序列是否为目标基因。24/61（2）从基因组DNA或mRNA序列克隆基因A、同源序列法和表示序列标签法同源序列法是依据基因家族组员所编码蛋白质结构中含有保守氨基酸序列特点发展一条快捷克隆即因家族未知组员新路径，即基于同源序列候选基因法。表示序列标签是指能够特异性标识某个基因部分序列，通常包含了该基因足够信息区，因而能够和其它基因相区分。当前，表示序列标签主要是经过cDNA路径取得。25/61B、依据连锁图谱克隆基因准确定位大片段DNA文库连锁分子标识筛选含目标基因大片段DNA克隆含目标基因精细物理图染色体步行分段制成探针cDNA文库目基因亚克隆文库含目标基因亚克隆序列分析及基因克隆目标基因图位克隆方法示意图26/61C、转座子标签法纯合体突变株核基因库1带转座子DNA片断野生型植株核基因库2完整目标基因互补测验检测功效转座子探针亚克隆片断做探针转座子标签法克盛大要农艺性状基因示意图27/61D、差异显示法在生物个体发育不一样阶段或是在不一样组织、空间进行有序表示方式，叫做基因差异表示。差异显示PCR是指经过对起源特定组织类型总mRNA进行PCR扩增、电泳，并找出待测组织和对照之间特异扩增条带，该条代就有可能是全长或是部分特异表示基因，利用这种方法进行基因克隆方式就是差异显示法基因克隆。现在又出现了限制性消减杂交（SSH）和RNA任意引物PCR（RAD-PCR）等各种方法。28/612、目标基因重组质粒构建质粒重组基本步骤：从原核生物中获取目标基因载体并进行改造；利用限制性内切核酸酶将载体切开，并用连接酶把目标基因连接到载体上，取得DNA重组体。29/6130/613、受体材料选择（1）良好植物基因转化系统应含有条件：高校稳定再生能力；受体材料要有较高遗传能力；含有稳定外植体起源；对筛选剂敏感。（2）惯用受体材料类型：愈伤组织再生系统直接分化再生系统原生质体再生系统胚状体再生系统生殖细胞再生系统31/614、转基因方法确实定和外源基因转化（1）.载体介导转移系统

将外源基因重组进入适合载体系统，经过载体携带将外源基因导入植物细胞并整合在核染色体组中伴随核染色体组一起复制和表示。

主要方法有：叶盘法真空渗透法原生质体共培养法32/61（2）.外源基因直接导入法这是一个不需要借助载体介导，直接利用理化原因进行外援遗传物质转移方法。

主要方法有：化学刺激法基因枪轰击法(genegun)高压电穿孔法(electroporation)微注射法(microfibers)超声波介导法脉冲电泳法离子束介导法33/615、转化体筛选和判定

1.转化体筛选2.转化体判定（1）DNA水平判定（2）转录水平判定（3）翻译水平判定6、转化体安全性评价和育种利用34/61二、转基因作物遗传特点（一）、外源基因整合机制1、同源重组整合（homologousrecombination）外源DNA与受体细胞染色体DNA上同源序列之间发生交换替换，并整合到受体染色体组上。2、位点特异性重组（site-specific

recombination）在两条DNA特异位点上，经过位点特异性重组酶作用对DNA进行特异性切割，实现外源基因整合。35/613、转座作用（transposition）经过体外重组将外源基因插入到转座子系统中，当携带有目标DNA片段重组转座成份复制并整合插入到染色体其它区域时实现外源基因整合。4、异常重组（illegimaterecombination）异常重组整合是外源基因整合到植物基因组最常见方式。36/61（二）、整合后外源基因在

植物体内表现共抑制：向受体植物种导入一个与受体内某基因同源基因，导入基因及受体内与它同源基因表示都可能减弱现象。基因缄默：转基因植株因为外源基因结构被破坏或者外源基因插入了染色体异染色质区域，出现外源基因序列不表示。37/61(三)、外源基因在后代中遗传规律分离类型家系数百分率1各位点整合（3:1）81522各位点整合不连锁（15:1）3221连锁（3:1<,<15:1）963各位点整合不连锁（63:1）963各以上位点（≥255:1）53例外（<3:1）2013累计15610038/61三、转基因作物品种选育（一）、转基因作物育种目标制订依据市场经济需要和生产发展前景依据不一样自然环境、栽培条件落实详细性状目标要考虑品种搭配要充分考虑转基因作物，尤其是外援目标基因对人类健康和环境安全影响39/61（二）、转基因方法确实定及转基因植株取得

（三）、转基因作物品种选育

纯系育种回交育种杂交育种杂种品种40/61（四）转基因作物生物安全性（1）转基因作物环境安全性转基因作物演变为农田杂草可能性基因漂流到近缘野生种可能性对自然生物类影响（2）转基因作物食品安全性(foodsafety)有毒物质(potentialtoxicity)过敏源(allergenicityofnewlyintroducedproteins)changesinconcentrationsofkeynutrientsornaturaltoxicants.41/6142/61第三节、分子标识辅助选择育种一、分子标识类型和作用原理1、分子标识类型和特点类型（按技术特征分类）Hibridisation-basedmarkers以分子杂交为基础DNA标识技术（RFLP标识、DNA指纹技术、原位杂交）PCR-basedmarkers以PCR反应为关键德DNA指纹技术（RAPD标识、SSR标识、SSLP标识、SCAR标识、AFLP标识、STS标识）Sequencingbasedmarkers新型分子标识（SNP标识、EST标识）

43/612、原理和遗传特征(1)RFLP标识A.RFLP标识原理

植物基因组DNA上碱基替换、插入、缺失或重复等，造成某种限制性内切酶酶切位点增加或丧失，从而产生限制性片断长度多态性。44/61基本步骤DNA提取用DNA限制性内切酶消化凝胶电泳分离，转移到滤膜上Southern杂交

放射性自显影或酶学检测

45/61B、RFLP标识特点

（1）遍布于整个基因组，数量几乎是无限；（2）无表型效应，不受发育阶段器官特异性限制；（3）共显性，可区分纯合子和杂合子；（4）结果稳定、可靠；（5）DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模育种实践中46/61（2）RAPD标识A、RAPD标识原理B、RAPD标识特点（3）AFLP标识A、AFLP标识原理B、AFLP标识特点47/61（4）SSR标识A、SSR标识原理依据微卫星DNA两端单拷贝序列设计一对特异引物，利用PCR技术，扩增每个位点微卫星DNA序列，经过电泳分析关键序列长度多态性。48/61基本步骤设计探针，筛选重组克隆依据SSR两侧序列设计并合成引物

PCR扩增反应

建立基因组DNA质粒文库对阳性克隆DNA插入序列测序凝胶电泳检测多态性49/61B、SSR标识特点（1）SSR标识为共显性标识，可判别出纯合子和杂合子。（2）重复性高，稳定可靠。（3）DNA用量少，对DNA质量要求也不太高。（4）使用SSR技术需要知道重复序列两翼DNA序列。50/61二、主要农艺性状基因连锁

标识筛选技术（一）、遗传图谱构建与主要农业性状基因标识1、遗传作图原理其原理是基于染色体交换与重组。在细胞减数分裂时，非同源染色体上基因相互独立，自由组合，而位于同源染色体上连锁基因在减数分裂前期I非姊妹染色单体间交换而发生基因重组，用重组率来表示基因间遗传距离。遗传图谱只显示基因间在染色体上位置，并不反应DNA实际长度。51/612、构建遗传图谱主要步骤：依据遗传材料之间多态性确定亲本组合，建立作图群体。对群体中不一样植株标识进行基因性分析。借助计算机程序构建连锁群3、构建遗传图谱，首先要选择适当亲本及分离群体，而且亲本之间差异不宜过大，不然会降低所建图谱准确度和适用性。4、用于分子标识遗传作图可分为两类：暂时性分离群体，包含F2群体、BC等

永久性分离群体，包含重组自交系群体、加倍单倍体群体等52/61自花授粉作物作图群体构建方法P1×P2F1F2F3F4F1B1:BC1F1×P1F1×P1F1×P1B2:BC2DHL异花授粉作物作图群体构建方法ABCDEfGAbcdEfg×AbCDEfGaBCdefg杂合F1对B、D、G位点来说，相当于F2对A、C、E位点来说，相当于测交F位点不分离53/61F2BC1DHRIL群体形成F1自交后代F1回交后代F1花粉分化个体F2个体自交后代性状研究对象个体个体品系品系准确度低低高高必要群体规模大大中中分离百分比1:2:3或3:11:11:11:1不一样作物群体特点54/61（二）、近等基因系培育与主要农艺性状基因标识（三）、群体分离分析法与主要农艺性状基因标识（四）、数量性状基因定位55/61三、作物MAS育种（一）、作物MAS育种须具备条件

分子标识与目标基因共分离或紧密连锁，普通要求二者间遗传距离小于5cM,最好1cM或更小。含有在大群体中利用分子标识进行筛选有效伎俩，主要是应用PCR技术。筛选技术在不一样试验室间重复性好，且含有经济、易操作特点。含有实用化程度高并能帮助育种家作出抉择计算机数据处理软件。56/61供体受体RRRrrr(1-P)22P(1-P)P2MRmrMRmr目标基因与DNA标识间遗传距离位p亲本中DNA标识带型F1杂种中DNA标识带型在F2分离群体中分子标识类型即MM,Mm,mmMM类型分子标识所代表目标基因型及其频率利用MAS遗传基础（以RFLP为例）M—抗性标识R—抗性基因m—感病标识r—感病基因57/61（二）、MAS育种方法

1、回交育种