氮限制对赤潮微藻生长的影响

氮限制对赤潮微藻生长的影响

1浮游植物的生态特性氮（n）是浮游植物生长最必要的养分之一，也是浮游植物生长最常见的限制因素（vitokandzhong，1991）。然而，随着近海沿岸氮污染的加剧，许多近海沿岸浮游植物的生长没有受到氮的限制（t社会学，1998；wandchu，2003；wangetal，2009）。然而，丰富的氮源显著增加了浮游生物的生物量。浮游生物，尤其是小型藻类广泛繁殖，能消耗水中原始的氮元素，水体中的氮元素不足，浮游生物的生长受到临时nn限制（riegan，1995）。不同赤潮藻对营养盐的需求存在差异,它们对营养盐的利用和营养盐限制的承受能力是其种间竞争重要的生态策略(Vuorioetal.,2005).虽然目前已有诸多报道研究了在实验室条件下营养盐限制对某一单种藻类生长的影响(JohnandFlyn,2000;刘东艳等,2002;吕颂辉等,2006),以及海洋浮游植物对营养盐结构失衡的响应(Andersonetal.,2002;HodgkissandLu,2004;Vuorioetal.,2005),但有关混合培养条件下营养盐限制对不同类型浮游植物生长和种间竞争影响的报道尚较少.因此,本研究选择了我国海域重要的3种赤潮藻类:无毒无害硅藻中肋骨条藻(Skeletonemacostatum)、无毒有害甲藻锥状斯氏藻(Scrippsiellatrochoidea)以及有毒有害针孢藻海洋卡盾藻(Chattonellamarina)作为实验材料,研究了N限制对其生长以及种间竞争的影响,以了解不同类别的赤潮藻类对N限制的响应,揭示我国沿海海域富营养化与有毒有害赤潮发生的关系.2材料和方法表面活性剂2.1培养基及培养方法中肋骨条藻(Sc)、锥状斯氏藻(St)和海洋卡盾藻(Cm)采自南海大亚湾海域,并在实验室进行分离、纯化,培养于暨南大学水生生物研究所的藻种室.从藻种室接种并扩大培养于新鲜的培养基中.实验前,接种3～4次使细胞达到同步培养.藻种驯化培养和扩大培养所用培养基中的N、磷(P)、硅(Si)营养元素浓度采用大亚湾养殖区自然海水水平,浓度分别设置为500μg·L-1(N)、74μg·L-1(P)、1000μg·L-1(Si),培养基中的N、P、Si分别由NaNO3、NaH2PO4、NaSiO3配制,其余元素与f/2培养基中相同.培养基所用人工海水由RedcoralSea牌无氮无磷海盐配制,pH值为7.9±0.1,盐度为31～33,经测定配制的人工海水中N、P水平为未检出.人工海水、培养基母液通过121℃高压蒸汽灭菌20min后,在无菌操作台中配制.所用容器等均经过高压灭菌后使用.培养在温度为(20±1)℃、光照约为60μE、光暗比为12h∶12h的恒温光照培养箱内进行培养.实验时,在250mL三角瓶内盛150mL培养基,接种0.5mL处于对数期的藻细胞,使实验培养液里初始细胞密度为600cells·mL-1左右,整个实验为一次性培养,各实验组均设3个重复.2.2np的表征设置3个N、P浓度梯度,对照组(C)的N、P含量根据大亚湾海水中最高N、P含量进行设置,分别为500μg·L-1(N)和74μg·L-1(P),N∶P接近Redfield比值(15∶1,原子比);两个N限制组(N1、N2)的营养盐含量是在P含量保持不变的情况下,改变N含量(分别为100和10μg·L-1),使N∶P原子比分别下降至3∶1和0.3∶1.除N、P浓度按实验规定设置外,实验培养液中的其余元素同2.1节.分别设置3种藻单种培养组(Sc组、St组、Cm组)、两两混合组(St+Sc组、St+Cm组、Sc+Cm组)和3种混合组(Sc+St+Cm组).2.3藻细胞计数时实验共进行了29d,实验前10d每2d计数1次,实验中期(10～22d)每隔4d计数1次,最后1次计数是在7d后的29d.藻细胞计数时,根据藻细胞的密度吸取藻培养液50μL,置于1mL计数框内,并用1滴甲醛固定,在OLYMPUSCX31显微镜下计数藻细胞和孢囊数目,并观察藻种的细胞形态.中肋骨条藻因细胞体积较小,根据其密度水平采用血球计数板计数或用lmL计数框计数.2.4计算的分析2.4.1两个营养细胞的形成率由于孢囊是营养细胞进行有性生殖的产物,一个孢囊形成需要两个营养细胞融合,因此计算孢囊形成率时,将一个孢囊计算为两个营养细胞,孢囊形成率用公式(1)进行计算(OlliandAnderson,2002;Wangetal.,2007):C=2C/(2C+N)×100%(1)式中,C为锥状斯氏藻孢囊数量,N为锥状斯氏藻营养细胞数量.2.4.2培养中下环境预容量比的确定在种群生态学中,环境容纳量(K)是指特定环境所能容许的种群数量的最大值.环境容纳量是环境制约作用的具体体现,有限的环境只能为有限生物的生存提供所需的资源,在本实验中的环境容纳量即最大细胞密度.因此,本文将环境制约条件下的环境容纳量与相应因子不受制约条件下环境容纳量的比值,称为相对环境容纳量(K′),见式(2),以比较环境制约(N限制与种间竞争)对种群增长的影响.K′=Kt/Kc×100%(2)式中,K′为各实验组某一种藻的相对环境容纳量,Kt为实验组中该藻的最大细胞密度(环境容纳量),Kc为同样N浓度条件下单种培养时该藻的环境容纳量;如果计算N限制组(N1、N2组)某一种藻单种培养时的相对环境容纳量,则Kc为该藻单独培养时对照组(C组)的环境容纳量.同样也计算了各实验组的相对孢囊形成率见式(3):C′=Ct/Cc×100%(3)式中,C′为各实验组锥状斯氏藻的相对孢囊形成率,Ct为实验组中的最大孢囊形成率,Cc为同样N浓度条件下单种培养时的最大孢囊形成率;如果计算N限制组(N1、N2组)锥状斯氏藻单种培养的相对孢囊形成率,则Cc为C组单独培养时锥状斯氏藻最大孢囊形成率.2.5统计分析所有实验结果均为3个实验组数据的平均值,数据误差线为3组数据间标准差.实验结果采用统计软件SPSS13.0进行显著性差异分析.3结果结果3.1n限制对骨条藻和海洋卡盾藻生长的影响图1为单独培养时,3种藻在不同N限制条件下的生长曲线.N限制对3种赤潮藻类的生长均具有明显的影响(p<0.05),而N1、N2两个N限制组之间没有显著差异(p>0.05).在N源充足的情况下,中肋骨条藻和锥状斯氏藻能快速进入对数生长期,细胞密度迅速增长,而在N限制条件下,则生长缓慢(图1a\,b).N限制条件下,海洋卡盾藻的生长趋势与对照组基本相近,经过了2～4d的迟滞期后,细胞密度缓慢增长(图1c).相对来说,N限制对骨条藻生长影响最为明显,N1和N2组的相对环境容纳量仅为C组的25%左右,锥状斯氏藻和海洋卡盾藻的相对环境容纳量分别为40%和70%左右(表1).3.2与中软骨条藻细胞的环境预困境状p图2至图4显示了在两种藻类混合培养条件下,3种赤潮藻类的生长状况.在混合培养条件下,N限制仍然明显影响藻细胞生长(p<0.05或<0.01),特别是在培养初期影响更为明显.两两混合培养时,锥状斯氏藻和海洋卡盾藻的生长趋势基本上与单种培养相近,但藻细胞生长受到种间竞争的明显抑制(p<0.01),具体表现为环境容纳量明显下降.与单种培养相比,锥状斯氏藻相对环境容纳量介于42.7%～70.0%,而海洋卡盾藻则为25.6%～61.0%之间(表1).在与中肋骨条藻的竞争中,锥状斯氏藻和海洋卡盾藻均处于劣势,两种藻细胞的环境容纳量均下降了50%以上(表1);而锥状斯氏藻与海洋卡盾藻的种间竞争能力相当,两种混合培养相对环境容纳量为60%～70%左右,相对来说锥状斯氏藻更具竞争力.在两两混合培养体系中,中肋骨条藻的生长曲线与单种培养具有较明显的差异(图2a,图3a),藻细胞首先经过一个快速增长期,细胞密度迅速增加,在其他两种藻类快速生长的第8～10d,中肋骨条藻细胞密度出现了下降趋势,并维持较低细胞密度至第18～22d,随后细胞密度又出现一定程度的增长,并达到其最大细胞密度.在不同N限制下,除个别混合培养组外,中肋骨条藻的环境容纳量并未见明显下降(p>0.05),相对环境容纳量一般超过80%(表1).3.33种藻混合培养体系对中骨折条藻生长的影响在3种藻混合培养条件下,N限制对藻细胞生长仍具有明显影响,同样中肋骨条藻对N限制最为敏感(图5),但在培养后期N限制组的藻细胞密度与对照组基本上不具明显区别(p<0.05).说明3种藻混合培养体系中,种间竞争已经成为藻细胞生长的决定性因素.与两种藻混合培养不同,中肋骨条藻在3种藻混合培养体系中的生长受到极大程度的抑制,环境容纳量比单种培养时下降了90%左右,相对环境容纳量仅为8.3%～14.6%(表1),说明骨条藻在与其他两种赤潮藻共存时,竞争优势大幅度降低.相反,在3种藻混合培养体系中,锥状斯氏藻和海洋卡盾藻的生长虽然劣于单种培养,但生长状况和环境容纳量与两种藻混合培养状况相近,甚至更佳(图2\,图3\,图5\,表1).说明在3种藻的混合培养体系中,锥状斯氏藻和海洋卡盾藻能对中肋骨条藻的生长产生联合抑制效应,较大程度地抑制了中肋骨条藻的生长.3.4种检测方法混合培养体系中孢囊的形成率锥状斯氏藻是极易形成孢囊的种类,在本实验中孢囊的最终形成率为52.3%～89.5%(图6).孢囊一般在藻细胞达到稳定生长期后的第10d左右形成,N限制以及种间竞争能促进孢囊的提前形成,在N限制组和混合培养体系中,孢囊可在培养的第6d开始形成.N限制不能明显促进孢囊形成率的提高,种间竞争能较大幅度促进孢囊的形成(p<0.05),混合培养体系中孢囊的相对形成率可达118.1%～170.4%(表1),特别是在竞争激烈的3种藻混合培养体系中,大部分锥状斯氏藻更以休眠孢囊的形式来逃避种间竞争压力.4讨论4.1中小型藻类优势种的确定在本研究中,N限制可明显影响3种赤潮微藻的生长,而在N充足的情况下,藻细胞生长良好.结果说明,近岸海域大量的N输入是海洋微藻快速繁殖、初级生产力上升的物质基础.如在南海大亚湾海域,近十几年来N含量急剧上升,1990年代后期以来可溶性无机N含量增长了4倍,与此同时N∶P上升了近20倍(彭云辉等,2002),其结果导致浮游植物细胞密度上升了10倍,初级生产力上升了4倍(刘胜等,2006),赤潮的发生也日趋频繁(李涛等,2005;Wangetal.,2009).实验结果同时显示中肋骨条藻对N限制较为敏感.中肋骨条藻是一种快速生长的小型硅藻,在其快速生长过程中需要消耗大量的营养盐,因此骨条藻对N限制的敏感性较强.此结果与许多研究报道以及海洋环境中的实际监测结果一致.一般认为,硅藻对Si和N的需求较高,N限制能抑制小型硅藻的生长;而P和N∶P则对鞭毛藻类的种群变动起重要作用,N∶P比值的下降可促进甲藻、针孢藻等鞭毛藻类取代硅藻占据优势(HodgkissandLu,2004;Ignatiadesetal.,2007).在近岸海域,随着N污染加剧,小型硅藻的优势度上升,我国大部分近岸海域的优势种类均为中肋骨条藻等小型硅藻类(吴玉霖等,2004;李艳等,2005;Wangetal.,2009;王雨等,2009).但是随着硅藻的快速繁殖,营养盐迅速消耗,导致海水中N元素会受到暂时性限制,此时甲藻、针胞藻等鞭毛藻类能利用其对N限制较强的耐受能力,占据竞争优势.因此,在自然海洋环境中,在硅藻水华过后,常常会伴随着鞭毛藻类水华的发生,这也是富营养化导致有毒有害赤潮频发的重要原因(Smayda,2004).4.2微藻生长的影响在两种藻类混合培养条件下,中肋骨条藻生长趋势发生了较为明显变化,具体表现为培养初期细胞密度的快速增长、培养中期的下降以及培养后期的第二次增长高峰.骨条藻的细胞大小以及快速增殖特征是混合培养体系中骨条藻生长曲线改变的重要原因.微藻的体积大小在浮游生物群落的结构、组成及种间相互作用中起着重要作用,个体小、比表面积大的微藻在对光照和营养盐的竞争中更易占据优势地位(Armstrong,2003).中肋骨条藻在3种微藻中个体最小(8.4μm长、6.5μm宽,n=20),为锥状斯氏藻(23μm长、21μm宽,n=20)的1/6.6,为海洋卡盾藻(36μm长、29μm宽,n=20)1/20,但在混合培养体系中,3种微藻的接种密度均为600cells·mL-1.因此,在混合培养体系中,即使在营养盐充裕的C组,中肋骨条藻虽然能利用其快速生长的特征使细胞密度得到快速增长,但由于占用的空间生态位较小,在培养中期细胞密度均出现了一定程度的下降,直至其他两种藻细胞进入稳定生长或衰亡期后才恢复生长.在3种藻混合培养体系中,由于锥状斯氏藻和海洋卡盾藻的协同作用,中肋骨条藻的生长受到更显著的抑制.这种现象与海洋环境中的赤潮发生规律一致,2003年8月在南海大亚湾海域发生了锥状斯氏藻和海洋卡盾藻的混合赤潮,持续了半个多月时间,而在此期间硅藻的生长受到抑制,直至赤潮消亡,硅藻才重新占据浮游植物群落优势(李涛等,2005).4.3种间竞争对孢囊形成的影响孢囊在赤潮形成和消亡过程中具有重要作用,而许多近岸赤潮藻类都具有形成孢囊的能力(VandenHoeketal.,1995).锥状斯氏藻是一种极易形成孢囊的赤潮藻类,在培养基中其孢囊形成率可以超过80%(OlliandAnderson;2002;曹宇等,2006).在本研究中锥状斯氏藻孢囊的形成率也较高,N限制和种间竞争能促使孢囊的提前形成,而混合培养体系中的种间竞争能明显提高孢囊的形成率(图6).结果说明锥状斯氏藻能通过孢囊的形成躲避外界不良条件,以保持种群数量(营养细胞和孢囊)的稳定,当环境条件改善时孢囊的萌发又可为水体提供大量营养细胞,从而为种群增长和赤