elisa测定的影响因素及操作要点

elisa测定的影响因素及操作要点

elisa是一种常用的固相酶免疫吸附试验，是一种常见的固相酶免疫计量法。ELISA试验以灵敏度较高、特异性较好的特点在临床上得到了广泛的应用,但ELISA测定中影响因素较多,而且其操作中有一定的技术要求,本文将从对ELISA测定中影响较明显的标本及操作因素两方面进行介绍。1样品因素对elisa的影响1.1elisa系统中互联反应型的检测(1)类风湿因子:人血清中IgM、IgG型类风湿因子(RF)可以与ELISA系统中的捕获抗体及酶标记二抗的FC段直接结合,从而导致假阳性。解决该情况的办法是:检测抗原时,可以用2-巯基乙醇等加入到标本稀释液中,使RF降解。(2)补体:ELISA系统中固相一抗和标记二抗过程中,抗体分子发生变构,其FC段的补体C1q分子结合位点被暴露出来,使C1q可以将二者连接起来,从而造成假阳性。解决的办法是:56℃,30min加热血清使C1q灭活。(3)交叉反应物质:类地高辛、类AFP样物质等,是与靶抗原有交叉反应的物质。在用多抗测定抗原时对测定结果影响不大,但在用单克隆抗体测定抗原时,如果交叉抗原决定簇正好是所用单克隆抗体相对应的靶决定簇时,也会出现假阳性结果。(4)标本中其它成分的影响:血清脂质过高、胆红素、血红蛋白及血液粘度过大等,均对ELISA测定结果有干扰作用。1.2elisa测定血清标本的干扰外源性物质常常是由于用于ELISA测定的血标本的采集、贮存等不当所致。如标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存过久、标本凝集不全和采血管中添加物等影响。(1)标本溶血:由于各种人为原因引起的标本溶血,均可因红细胞破坏溶解时释放出大量具有过氧化物酶活性的血红蛋白,在以辣根过氧化物酶为标记的ELISA测定中,会导致非特异性显色,干扰测定结果。为克服上述干扰作用,标本采集时必须注意避免溶血。(2)标本受细菌污染:因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶,因此,被细菌污染的标本同溶血标本一样,亦可产生非特异性显色而干扰测定结果。(3)标本保存不当:在冰箱中保存过久的标本,血清中IgG可聚合成多聚体、AFP可形成二聚体,在间接法ELISA测定中会导致本底过深、甚至造成假阳性;标本放置时间过长(如1d以上),有时抗原或抗体免疫活性减弱,亦可出现假阴性。为克服上述干扰,ELISA测定的血清标本宜为新鲜采集;如不能立即测定,5d内测定的血清标本可存放于4℃,1周后测定的血清标本应低温冻存;冻存后融解的标本,蛋白质局部浓缩,分布不均,应充分混合后再测定,但混匀时应轻柔,不可强烈振荡。(4)标本凝集不全:在没有促凝剂和抗凝剂存在的情况下,正常血液采集后1/2～2h开始凝固,18～24h完全凝固。临床检验工作中,有时为了争取时间快速检测,常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清,此时的血清中仍残留部分纤维蛋白原,在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块,易造成假阳性结果;这类情况于次日复查时因血凝已完全,血清中不再有纤维蛋白原存在,故复查结果变为阴性。为避免上述干扰作用,解决的办法最好是血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清,或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。(5)标本管中添加物质的影响:抗凝剂(如肝素,EDTA)、酶抑制剂(如NaN3可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性)及快速分离血清的分离胶等均对ELISA测定有一定干扰作用。2操作因素对结果的影响2.1试剂准备从冰箱中取出的试验用试剂应待其温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。不然会影响结果。2.2加标本、加样在ELISA中一般有3次加样步聚,即加标本,加酶结合物,加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可溅出,不可产生气泡。加标本一般用微量加样器,按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴,以免发生交叉污染,也可用一次性的定量塑料管加样。有些测定(如间接法ELISA)需用稀释的血清,可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液,再在其中加入血清标本,然后在微型震荡器上震荡1min以保证混和。2.3封片或加固孔壁ELISA方法的保温最好在水浴条件下进行,以减少边缘效应。浴温时应贴封片或加盖,防止标本或稀释液蒸发,吸附于孔壁;在室温比较高的条件下,大批量加样时最好使用多通道加样器以减少孵育时间人为延长而导致非特异性结合紧附于反应孔周围,难以清洗彻底现象。2.4非特异性吸附型干扰物洗板的制备洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤,但却也决定着实验的成败。ELSIA就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质,以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的,而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物。采用手工洗板,应防止孔与孔之间液体交叉;采用半自动洗板机洗板时,洗液量不足,导致洗板不彻底;洗板针堵塞,抽吸不完全;洗板不畅,导致洗板效果差;反应板过多造成洗板等待时间长。解决方法:保证洗液注满各孔,洗板针畅通,洗完板后最好在吸水纸(选择干净、无或少尘的吸水材料)上轻轻拍干;合理安排,或多用几台洗板机。2.5影响判定结果的因素显色剂配制后放置时间过长或使用过期显色剂;加显色剂时溅出孔