刺梨茎尖超低温保存技术研究

刺梨茎尖超低温保存技术研究

罗地亚-温佩其斯特利斯特利斯是中国独特的开发潜力和可接近的现代养分健康水果。刺梨资源丰富,其保存主要以田间种植保存为主,但这种方式难以避免自然灾害、病虫危害以及人为破坏,而常规离体保存又存在经常继代、容易污染以及试管苗变异等问题。目前超低温保存被认为是植物种质资源长期稳定保存的最理想方法,已成功保存许多果树种质资源[2,3,4,5,6,7,8,9,10,11],但刺梨超低温保存技术体系尚未建立。我们以刺梨为材料,研究影响刺梨茎尖超低温保存的一些因素,以期为刺梨种质资源长期稳定保存提供新的方法。1材料和方法1.1ghii接种法材料为贵州大学喀斯特山地果树资源研究所刺梨资源圃内‘贵农5号’刺梨(Rosaroxburghii‘Guinong5’)。选取健壮、带有腋芽的茎段,剪成长为1~2cm小段,用洗涤剂洗去外植体表面上的污渍,用自来水洗净,然后在超净台上用0.1%的升汞灭菌8min,再用无菌水清洗3~4次,接种于不同培养基中,重复3次。培养温度为(25±2)℃,每天光照14h。1.2玻璃法保存1.2.1植物叶片蔗糖浓度和预培养时间对茎尖蔗糖浓度的影响选择腋芽生长健壮的无菌试管苗,切取长度约0.5cm的腋芽茎尖,接种于MS+0.5mg·L-16-BA+0.05mg·L-1IAA培养基中,开展不同蔗糖浓度(0.1、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mol·L-1)和预培养时间(0、1、2、3、5、7d)的单因子试验,其中不同蔗糖浓度试验中茎尖预培养为3d,不同时间预培养试验中蔗糖浓度为0.3mol·L-1,均重复3次。1.2.2冷冻管生长预培养后,在解剖镜下剥取含有1~2个叶原基的茎尖,长度约为2mm,转移于1.8mL冷冻管中,每管10个茎尖。室温下在经过高温灭菌的LS装载液(MS+2.0mol·L-1甘油+0.4mol·L-1蔗糖)中处理不同时间(0、20、30、40、50、60min),重复3次。1.2.3不同时间液氮液的制备经过以上处理后的茎尖,用玻璃化液PVS2(MS+30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亚砜+0.4mo1·L-1蔗糖)于0℃处理不同时间(0、10、20、30、40、50、60、70min),再将茎尖转入已预冷的装有新鲜玻璃化液PVS2的冷冻管中,然后将冷冻管装在金属套上,套上一根细线,最后将冻存管迅速投入液氮中保存。每处理2管,重复3次。1.2.4ms0.3mol-1-4和ms-1a/o的恢复培养基的制备保存24h后,从液氮中取出冷冻管,在40℃水浴锅中化冻,用MS+1.2mol·L-1蔗糖+100mg·L-1Vc+0.5mg·L-1GA3培养基洗涤2次,每次10min。然后取出茎尖,用无菌滤纸吸去残留洗涤液,转接到MS+0.3mol·L-1蔗糖培养基上暗培养1d,然后接种到MS+0.1mg·L-16-BA+0.05mg·L-1IAA+30g·L-1蔗糖的恢复培养基上,暗培养7d后转入光下培养。20d左右统计成活率(转为绿色,伸长的茎尖占全部试验茎尖数的百分率)2结果与分析2.1茎段组内部的化程度不同培养基上刺梨腋芽萌发率都超过90%(表1),各处理间差异不显著。但各培养基中芽的质量、长势以及茎段基部愈伤化程度有明显差异,其中处理1和处理4的芽长势好,芽大,健壮(图版-A),但后者茎段基部愈伤化严重。而处理2和处理3芽长势中等,芽较小。通过预备试验发现,生长健壮的芽,其茎尖超低温保存再生成活率高,因此,从茎尖生长情况来看,适合超低温保存材料诱导的适宜培养基为MS+0.5mg·L-16-BA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂。2.2-ba浓度对茎尖成活率的影响切取长度约2mm的无菌苗腋芽茎尖,转接到含有不同浓度6-BA和0.05mg·L-1IAA的MS培养基上,结果表明(表2),不同浓度6-BA对刺梨茎尖的生长有很大影响。当6-BA浓度为0.1mg·L-1时,茎尖成活率最大,为91.1%,与其他各处理相比达到极显著水平,且茎尖生长良好。随着6-BA浓度的继续增加,茎尖成活率大幅度下降,当6-BA浓度升至1.5mg·L-1及以上时,该培养基中茎尖成活率低于未添加6-BA时的茎尖成活率,且茎尖长势一般。结合茎尖成活率及生长情况,以MS+0.1mg·L-16-BA+0.05mg·L-1IAA的组合适合刺梨微茎尖的生长。在接种30d后,就可从2mm左右,发育成健壮绿苗,长势良好,可进行生根与移栽。该结果可以为冷冻后材料的恢复生长奠定技术基础。2.3蔗糖浓度对moll-1的影响预培养蔗糖浓度对刺梨茎尖超低温保存后的成活率有很大的影响。由图1可知,随着预培养基中蔗糖浓度的增加,茎尖成活率呈先增高后降低的趋势。当蔗糖浓度为0.3mol·L-1时,保存效果最好,成活率达37.4%,但与蔗糖浓度为0.4mol·L-1时的茎尖成活率36.5%没有显著差异。当随着蔗糖浓度的进一步增加,茎尖成活率迅速下降,当蔗糖浓度为0.7mol·L-1时,成活率仅有15.5%,其原因可能是蔗糖浓度过高,细胞产生了渗透胁迫,使细胞受损所致。而0.3mol·L-1与0.4mol·L-1浓度的蔗糖可很好地增强细胞的渗透性及降低分生组织的水分含量。综合考虑预培养的蔗糖最适浓度为0.3mol·L-1。2.4预培养时间对刺梨茎尖成活率的影响由图2可以看出,在MS+0.5mg·L-16-BA+0.05mg·L-1IAA+0.3mo1·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂的培养基上培养的刺梨茎尖随着预培养时间的延长,茎尖成活率先增加后降低。预培养3d效果最好,茎尖成活率达40.1%,显著高于其他各处理;可见,预培养时间对刺梨茎尖超低温保存成活率有显著的影响,但预培养时间要适宜,过短脱水不充分,过长细胞脱水过渡,均会导致成活率下降。因此,用0.3mol·L-1蔗糖进行预培养,其最佳的预培养时间为3d。2.5ls装卸液预处理对超低温保存效果的影响装载预处理是一个渗透保护的处理过程,可以初步降低组织的含水量,避免由于渗透压变化太强而对材料造成伤害。图3结果显示,LS装载液预处理对超低温保存效果有明显的影响。不经过装载液处理的茎尖几乎不能成活,当装载处理时间为50min时,成活率高达41%,装载处理时间为60min时,成活率下降为28.6%。可见,装载液预处理是刺梨茎尖的玻璃化法超低温保存必不可少的关键环节,刺梨茎尖以在LS装载液中处理40~50min效果较好。2.6刺梨茎尖在不同时间下的存活率及成活率将经过装载预处理50min的茎尖,在0℃处理0~70min(图4),结果表明,随着处理时间的增加,刺梨茎尖的成活率呈先增大后减小的趋势。未经处理的,保存后茎尖全部死亡;当处理时间为40min时,刺梨茎尖的保存成活率最高,达47.2%,显著高于其他各处理;当处理时间为70min时,成活率降为30.6%,原因可能是PVS2的过度脱水及处理时间过长对材料造成伤害所致。由此可知,PVS2处理对刺梨茎尖玻璃化法超低温保存的成功至关重要,处理时间准确把握,可使茎尖成活率达到其最高水平,其最佳处理时间为40min。2.7a+30gl-1蔗糖+7gl-1相结合物的培养解冻后,将茎尖接种到恢复培养基MS+0.1mg·L-16-BA+0.05mg·L-1IAA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂上,茎尖保存成活率为44.3%。试验中发现,接种2d后大部分茎尖基部绿色褪去,变为褐色,7d后成活的茎尖转为绿色(图版-B),大部分茎尖伸长,直接成苗(图版-C),一定时间后个别植株生根(图版-D),而个别转绿茎尖则形成愈伤组织。3材料的预处理。在已经设置时,各在植物茎尖超低温保存研究中,大多以继代苗的茎尖作为保存材料,可能是因为通过继代培养可以提高细胞分裂与分化的同步化频率,从而提高超低温保存的存活率。但本研究中,刺梨继代苗的茎尖长势弱,茎尖不明显,而采用初代诱导苗的腋芽大、健壮,茎尖明显,适合作超低温保存材料,这在葡萄、柿离体茎尖超低温保存中,也发现顶芽茎尖保存后不易成活,而腋芽茎尖保存后再生率较高的现象。要使保存后的茎尖能够成活,茎尖的大小要适当。过大不利于脱水,过小易造成机械损伤。因此,在剥取茎尖时,一定要尽量减少机械损伤,这也是刺梨保存成功的关键。本试验切取刺梨茎尖长度为2mm左右,保存效果较好。一般情况下,在进行植物茎尖超低温保存前,对材料进行预培养,可以提高超低温保存后的成活率。用高浓度的蔗糖进行预培养是较为常用的方法,但本研究先期仅选用高浓度蔗糖进行预培养,保存效果不好,成活率低。而改用高浓度蔗糖结合低温(4℃)对刺梨茎尖进行预培养,保存效果较好。预培养除了要求方法适当外,预培养的时间也要适宜。本研究预培养3d,保存效果较好,而预培养时间过长或过短,则成活率都会降低,这与前人研究结果一致。此外,蔗糖浓度过高或者预培养时间过长,材料会出现黄化、水渍化和生活力降低甚至死亡的现象,可能是由于材料脱水过度、细胞产生了渗透胁迫所致。本研究发现,在恢复培养时不进行暗培养