地中海贫血基因诊断课件

地中海贫血基因诊断LOGO地中海贫血基因诊断LOGO地中海贫血

地中海贫血介绍1

发病机制2

基因诊断和治疗3地中海贫血地中海贫血介绍11925年,Cooley描述了一个幼儿患有贫血,并伴发有有核红细胞增多症.此后,意大利,希腊等地中海区域也陆续发现并报道类似疾病,因该病首先在地中海区域发现,因此被称为地中海贫血.(thalassemia).“地中海贫血症”来源1925年,Cooley描述了一个幼儿患有贫血,并伴发有有核地中海贫血症介绍地中海贫血(THAC)是一种较为常见的单基因遗传性疾病，多出现在我国的南方各省，又以海南及两广沿海地区多发。其主要致病机制为α珠蛋白或β珠蛋白基因出现缺失或具有缺陷，从而引起血红蛋白中不同肽链出现合成比例失衡，进而导致了溶血性贫血疾病的发生。地中海贫血症介绍珠蛋白基因的结构及表达1.珠蛋白基因的结构α珠蛋白基因簇16p13β珠蛋白基因簇11p15珠蛋白基因的结构及表达1.珠蛋白基因的结构α珠蛋白基因簇地中海贫血的分型

·α地中海贫血：根据造成人贫血病情的严重性将其分为4种类型。·β地中海贫血：根据造成病情的严重性分为3种类型：

·重型地中海贫血

·中间型地中海贫血

·轻型地中海贫血地中海贫血的分型·α地中海贫血：根据造成人贫血病情的严重性α地中海贫血(α地贫)的类型名

称

基因型

缺失基因

a链的合成

Bart’s水肿胎儿综合征

a0/a0

――/――

0

HbH病

a＋/a0

α―/――

25％

标准型

aA/a0

αα/――

50％

a＋/a＋

α―/α―

静止型

aA/a＋

αα/α―

75％

正

常

aA/aA

αα/αα

100％

缺失一个α基因——尚有部分α链合成者，α+地贫；缺失两个α基因——α链完全不能合成者，α0地贫。α地中海贫血(α地贫)的类型名称基因型缺失基因a链4个α基因缺失→→α珠蛋白缺失→→γ4/高氧亲和力→→组织严重缺氧A.HbBart’s胎儿水肿综合症4个α基因缺失→→α珠蛋白缺失→→γ4/高氧亲和力→→组织严3个α缺失→β4

B.血红蛋白H病（α0/α+）高氧亲和力→组织缺氧H包涵体→溶血→贫血3个α缺失→β4C.标准型α地中海贫血

（α0/αA或α+/α+）D.静止型α地中海贫血（α+/αA）C.标准型α地中海贫血

（α0/αA或α+/α+）D.静

重型

地贫：(0／

0、+／

+、0／

0)

轻型

地贫：(0／

A、0／

A、0／

A)

中间型

地贫：(+(高F)／

+(高F)、+／

+)

遗传性胎儿血红蛋白持续增多症(HbFα2γ2)地贫临床类型

β珠蛋白生成障碍性贫血重型地贫：(0／0、+／+、0／A.重型β地中海贫血患者不能合成β链α链过剩而沉降到红细胞膜上，引起膜的性能改变，发生严重的溶血反应，引起肝脾增大。组织缺氧，促进红细胞生成素分泌，刺激骨髓增生，骨质受损变得疏松，可出现鼻塌眼肿、上颔前突、头大额隆等特殊的“地中海贫血面容”。A.重型β地中海贫血患者不能合成β链地中海贫血基因诊断课件B.中间型β地中海贫血

一般是β+地中海贫血基因的纯合子，患者的基因型通常为β+（高F）／β+（高F）或β+／δβ+。病人的症状介于重型和轻型之间，故称为中间型。C.轻型β地中海贫血

发生于β0或β+地中海贫血基因的杂合子，无任何临床症状。B.中间型β地中海贫血C.轻型β地中海贫血D.遗传性胎儿血红蛋白持续增多症HbFα2γ2遗传缺陷导致δ和β基因表达受到抑制，而γ链合成却异常增高，使成人红细胞内的胎儿血红蛋白HbF持续增多。D.遗传性胎儿血红蛋白持续增多症HbFα2γ2地中海贫血的分子机制α地中海贫血的分子机制地中海贫血的分子机制基因缺失：缺失型α地中海贫血基因突变：非缺失型α地中海贫血基因缺失基因突变编码序列突变；转录调控序列突变（TATAbox)；RNA加工和修饰信号序列突变（GT-AG接头）地中海贫血的分子机制α地中海贫血的分子机制地中海贫血的分地中海贫血基因诊断课件地中海贫血基因诊断α地中海贫血的基因诊断步骤PCR扩增基因型分析

α地中海贫血的基因诊断结果地中海贫血基因诊断α地中海贫血的基因诊断步骤PCR扩增基因PCR扩增缺失型突变检测PCR反应条件为:95℃预变性5min，98℃

45s，66℃30s，72℃

3min，35个循环，最后72℃延伸5min。非缺失型突变检测PCR反应条件为:94℃预变性5min，94℃60s，55℃30s，72℃60s，35个循环，最后72℃延伸5min。PCR扩增基因型分析将上述PCR扩增产物与膜条100℃变性10min，43℃杂交2h以上，洗膜，加入酶标抗生物素蛋白，再次洗膜，加入酶底物显色，具体步骤按说明书进行操作。杂交及显色完成后，观察膜条上的蓝色斑点，若只有野生型探针处(N)显色，为该位点的野生纯合子;若只有突变型探针处(M)显色，为该位点的突变纯合子;若野生型探针处(N)和突变型探针处(M)均显色，为该位点的杂合子。基因型分析α地中海贫血的基因诊断结果样本基因型缺失型和非缺失型α－地贫基因突变检测结果见图1和图2。图1缺失型α－地贫基因突变检测结果图2非缺失型α－地贫基因突变检测结果α地中海贫血的基因诊断结果图1缺失型α－地贫基因突变检测结β地中海贫血的基因诊断步骤

PCR扩增反向点杂交(reversedot-blot,RDB)杂交结果判定

α地中海贫血的基因诊断结果β地中海贫血的基因诊断步骤

PCR扩增反向点杂交(revPCR扩增

抽取受检者EDTA抗凝血2ml，按试剂盒操作说明书提取患者DNA,在A、B两管PCR反应液中分别加入提取的DNA2ul。PCR反应条件为:93℃预变性5min;93℃变性30s,复性60℃

30s,72℃延伸1min,35个循环;最后72℃延伸5min。PCR扩增反向点杂交(reversedot-blot,RDB)

将上述PCR扩增产物与膜条100变性10min,42℃杂交4h以上,洗膜,加入酶标抗生物素蛋白,再次洗膜,加入酶底物显色,观察结果。具体步骤按说明书进行操作。反向点杂交(reversedot-blot,RDB)

杂交结果判定

杂交结果判定

杂交结果判定

杂交膜条上结合的14种ASO探针排列顺序见表1。探针排列成3排,上排和中排分别对应8种常见突变位点的野生型(N)和突变型(M)探针,下排分别对应显色反应控制点,空白点和6种稀少突变位点的突变型(M)探针。杂交及显色完成后,显色反应控制点呈边缘清晰的蓝色圆点,否则需要重新检查杂交过程。所有的野生型(N)显色,突变型(M)不显色为正常人;某一位点的野生型(N)和突变型(M)均显色,为这一位点的杂合子;某一位点只有突变型(M)显色,野生型(N)不显色,为这一位点的突变纯合子;某两个位点的野生型(N)和突变型(M)均显色,为这两个位点的双重杂合子。杂交结果判定β地中海贫血的基因诊断5种突变等位基因β地中海贫血的基因诊断5种突变等位基因关于基因治疗的展望不久的将来,人类可望在基因的分子结构上自我认识,了解人体内60兆个细胞中的约10万个基因以及它们的特征和功能,这样影响人类健康的所有疾病均能作预防基因治疗,我们期待着这一天的早日到来。关于基因治疗的展望不久的将来,人类可望在基因的分子结参考文献[1]《地中海贫血88例基因诊断结果分析》[2]《地中