微波法制备胶体金全抗原及其抑菌性能研究

微波法制备胶体金全抗原及其抑菌性能研究

氨基溶胶（pm）是氨基溶胶中的一种抗生素，其母核为酪氨酸和内酰胺环。由于其抗菌谱比青霉素G广,对革兰氏阴性和阳性菌均有抑制作用,再加上毒性低,价格便宜,在免疫检验、快速诊断、生物传感器、植物保护等领域有广泛的应用。由于经济利益驱使和人们对抗生素残留后的危害认识不足,导致食品和环境中青霉素类抗生素的残留,从而引起一系列安全隐患。1857年,法拉第用氯金酸溶液制得胶体金,发现在其中加入少量电解质后,可使它由红色变成蓝色,最终凝集为无色,而加入明胶等大分子物质后,可以阻止这种改变。这一发现奠定了胶体金制备和应用基础,1971年Faulk等把他用于细胞结构的透射电镜研究,胶体金制备和应用研究。由于胶体金具有较高电子密度,对生物活性物有良好吸附性能,当作为配体的某些生物活性物与胶体金混合后便被吸附并保持其活性,同时胶体金易于制备和定量,稳定性好,能渗入超薄切片的细胞内部作为标记物,从20世纪80年代起其研究报道呈上升势态。胶体金标记技术已经成为继酶标记、放射免疫标记、荧光标记3大标记技术后,免疫标记技术的又一大进步。最近,俄罗斯科学家研究表明,胶体金能够促使机体对抗生素等小分子类抗原产生强烈免疫应答,使小鼠免疫系统的吞噬特性增强,产生大量抗体。目前国内外已经有约20余种商品化胶体金试剂盒出售,如最常见的早孕检测试纸、淋病检测盒等,除毒品和兴奋剂以外,其他小分子化合物的残留检测方面的研究和应用却很少见报道,更未见有应用胶体金标记法来快速检测氨苄青霉素残留的报道。为此,本文以微波法制得胶体金,并用戊二醛和EDC两种方法制得氨苄青霉素的全抗原,根据正负电荷作用,硫键结合和表面疏水力结合状况,制得氨苄青霉素的胶体金结合物,并对其活性进行了检验。为免疫法快速检测氨苄青霉素残留和电化学生物传感器监测系统的建立以及高效价抗体的产生奠定了坚实的基础。1材料和方法1.1材料表面1.1.1菌株、仪器和分析方法氯金酸(HAuCl4)、柠檬酸三钠,分析纯,天津市英博生化试剂有限公司;氨苄青霉素(AMP)、牛血清白蛋白(BSA),北京鼎国生物技术有限公司;戊二醛(GA),分析纯,天津瑞金特化学品有限公司;碳二亚胺盐酸盐(EDC),分析纯,上海Sanland国际化学品有限公司;0.01mol/LpH7.4的PBS缓冲液、0.1mol/LpH4.7的MES缓冲液为自配;无菌LB培养基,自配;其他试剂均为国产分析纯。1.1.2红外分光光度计JB-4A恒温磁力搅拌器,上海理达仪器厂;WD800T微波炉,格兰仕电器有限公司;UVPC-2401紫外可见光分光光度计,日本岛津;VECTOR22傅立叶红外分光光度计,德国布鲁克;高速冷冻离心机,日本日立;FDU2200冷冻干燥机,日本RIDUKAKIKAI;恒温培养箱,上海智城分析仪器有限公司。1.1.3试验消毒试验菌株为大肠杆菌BL211.2方法1.2.1胶体金的制备按照文献,先将0.1×10-4mg/mLHAuCl4溶液100mL放入微波炉中,高档沸腾2min,迅速一次加入4.0×10-2mL1mg/mL柠檬酸钠水溶液,放入微波炉中在中档保持3min,后呈现透明的橙红色,即为15nm的胶体金。待液体凉后,用分光光度计测定其吸收曲线,避光4℃保存。1.2.2edc法和pbs的反应GA法10mg氨苄青霉素溶于4mL二甲基甲酰胺中,然后加到8mL溶有100mg蛋白质的PBS溶液中,而后在上述混合液中逐滴加入75μL质量分数25%的戊二醛。在室温下用磁力搅拌器轻柔搅拌3h后,将反应物取出,PBS透析72h,每12h换一次透析液。EDC法10mg牛血清白蛋白溶于1mL去离子水,振荡,使之充分溶解,10mg氨苄青霉素溶于2.5mLMES缓冲液中,将此两溶液混合振荡均匀。取50mg碳化二亚胺完全溶解于5mL去离子水中,加入前面混合液中混匀,避光,静置,室温反应4h,5000r/min离心10min,将上清液用PBS透析72h,每12h换一次透析液。两种产品均小瓶分装,标记后-20℃保存。溶液中偶联物的绝对含量通常以蛋白质的相对浓度来表示,按照Bradford染色法,绘出BSA含量的标准曲线,对应曲线回归出两种方法全抗原中蛋白质的浓度。用紫外-可见光分光光度计扫描浓度均为1mg/mL的氨苄青霉素、BSA和全抗原溶液,对两种方法的偶联比进行估测。1.2.3胶体金-act全抗原结合物的制备采用Mey氏稳定化实验确定最小蛋白用量,其操作过程为:在酶标孔中分别加入pH6.0胶体金100μL,而后加入不同量的待标记物,混均匀后各加入20μL质量分数10%NaCl溶液,10min后肉眼观察反应结果。取包被的临界值的1.3倍作为标记物的最佳使用量。将上述确定的两种最佳全抗原用量和胶体金溶液,在磁力搅拌器下混合数分钟后,加入一定量的PEG20000溶液,使其最终质量浓度为0.5g/L;即为胶体金-AMP全抗原结合物。标记后的胶体金-AMP全抗原结合物先以1200r/min,4℃离心20min,弃去凝聚的沉淀,而后16000r/min,4℃离心1h。重复离心两次,用PBS液悬浮洗涤,而后将沉淀悬浮为原体积的1/10,4℃保存。氨苄青霉素与胶体金的直接结合,采用上述相同的方法。将结合物在去离子水中透析24h后,置于变色硅胶中浓缩至原体积的1/10,4℃保存。两种方法全抗原与胶体金的结合物和AMP与胶体金的直接结合物进行冷冻干燥,用红外分光光度计检测结合的具体情况。1.2.4抑菌环情况测定参考杯碟法操作,制成双层平板,在牛津杯孔中分别加入100μL的AMP,GA法全抗原,EDC法全抗原,AMP-胶体金直接结合物,GA法全抗原-胶体金结合物,EDC法全抗原-胶体金结合物,37℃培养24h后观察抑菌环情况。2结果与分析2.11扫描线的建立胶体金的粒径不同会呈现相应的颜色,15nm胶体金会呈现红色,颗粒粒径(10～70nm)与最大吸收峰之间呈线性相关,基本符合如下直线回归方程:Y=0.4271X+514.56。最大吸收峰主峰宽度越小,颗粒越均匀;主峰宽度越大,颗粒越不均匀。用紫外-可见光对样品进行扫描,曲线见图1。用此微波还原法制得的胶体金在520.5nm处有最大吸收峰,回归方程知道粒径均值为13.9nm,且此峰相当凸出,峰宽较小,判断以此方法得到的胶体金颗粒粒径基本上都在15nm左右,符合试验要求。2.2全抗原吸收峰的测定以考马斯亮蓝溶液作为空白,不同浓度的BSA在595nm下的标准曲线如下图2。将两种方法所得的全抗原取与标准曲线对照染色,对应标准曲线函数计算出相应的浓度,再将其稀释为0.1g/L,测定200～400nm的吸收峰情况,见图3。根据偶联比计算公式计算得两种方法的偶联比,戊二醛法为9∶1,EDC法为15∶1,这与文献基本上保持一致。2.3氨苄激素的偶联临界值在Mey氏稳定化实验中,GA法全抗原的胶体金变色临界值为2.5μL,EDC法全抗原的临界值为3μL,氨苄青霉素的直接偶联临界值是在经过2h室温反应的情况下为50μL左右。因此确定3种情况标记胶体金的最佳量为:GA法全抗原30μL/mL胶体金,EDC法全抗原40μL/mL胶体金,AMP500μL/mL胶体金。2.4胶体金的结合采用固体KBr压片,以BSA、AMP、胶体金晶体的红外光谱作为对照,检测上面3种方法偶联AMP和胶体金的结合情况,见图4。从图4可以看出,AMP在1780cm-1处有β-内酰胺环的特征吸收峰,AMP-胶体金结合物此处不出峰,而在GC法全抗原-胶体金结合物和EDC法全抗原-胶体金结合物此处均有比较明显的吸收峰,说明用全抗原的方法偶联胶体金能够将AMP和胶体金颗粒比较牢固的结合到一起。2.5活性产物的活性利用抗生素对细菌的抑制作用产生的抑菌环来验证偶联物中抗生素的活性和偶联状况,见图5。从图5可以清晰地看出GA法和EDC法两种方法制备的全抗原保留明显的抗生素活性,对大肠杆菌生长有明显的抑制作用。采用GA法制备的全抗原与胶体金的结合物有较强的抗原活性,而EDC法制备的全抗原与胶体金的结合物仅能表现出不明显的抑菌效果,AMP和胶体金的直接结合物基本上看不出任何生物抑菌效果。3缺陷的抗原活性两种偶联方法制备的全抗原均有较好的活性,但当将小分子半抗原、两种全抗原与胶体金颗粒相结合时,红外检测表明两种全抗原能够与胶体金结合,抑菌试验却表明只有GA法制得的全抗原和胶体金结合物能保持较好的抗原活性,分析原因如下:(1)GA作为偶联剂是在氨苄青霉素的氨基端和蛋白质的氨基端通过GA的两个醛基形成了席夫碱结构而偶联,但EDC作为偶联剂则部分是通过噻唑环上的羧基和蛋白质的氨基端反应而偶联,此时抗原决定簇因为蛋白质的位阻效应可能会不能全部呈现出来。(2)EDC使用的最佳pH4.7可能会导致部分特征官能团开环变化,引起抗生素降解。(3)标记物与胶体金的结合反应中,主要通过蛋