医学教学课件：胚胎干细胞

胚胎干细胞

EmbryonicStemCells

长期以来，人类一直在研究和寻找能治愈各种疾病、抗衰老甚至长生不老的方法。随着现代科学技术的发展，尤其是干细胞的研究，人类的这些幻想正在逐步变成现实。

1999年12月，美国《科学》杂志公布了当年世界科学进展的评定结果，干细胞的研究成果列在举世瞩目耗资巨大的人类基因组工程之前，名列十大科学进展首位。

…………卵裂与胚泡形成（一）卵裂（cleavage）是指受精卵不断分裂的过程。卵裂产生的细胞称为卵裂球桑椹胚（二）胚泡形成（囊胚）随着卵裂球增多，在桑椹胚细胞之间出现一些小的腔隙，以后汇合成一个大腔，将桑椹胚细胞推到周边，形成胚泡滋养层内细胞群胚泡腔囊胚滋养层

胎盘及胎儿附属结构内细胞群内胚层

消化道、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰中胚层

结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统外胚层

体表结构；神经系统干细胞的基本概念定义干细胞是一类具自我更新和分化潜能的细胞。在细胞的分化过程中，细胞往往由于高度分化而完全失去了再分裂的能力，最终衰老死亡。机体在发展适应过程中为了弥补这一不足，保留了一部分未分化的原始细胞根据分化潜能：全能干细胞，包括：胚胎干细胞（embryonicstemcells,ES细胞），生殖干细胞（embryonicgermcells,EG细胞）,胚胎癌细胞（embryonalcarcinomacell，EC细胞）具有全能性，能够分化成全身200多种细胞类型，进一步形成机体的任何组织和器官。多能干细胞：具有分化成多种细胞和组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力,如造血干细胞。专能干细胞：只能向一种或密切相关的两种类型的细胞分化。如上皮组织基底层的干细胞，肌肉中的成肌细胞。根据发育过程中出现的先后次序：

胚胎干细胞成体干细胞

存在于已分化组织细胞中尚未分化的细胞，具有自我更新的潜能并且能够分化成该组织的各种类型细胞，如造血干细胞。

横向分化（trans-differentiation）一种组织的特异性干细胞可以横向分化成其他组织的细胞，如肌肉干细胞在特定条件下可以分化为各种血细胞系。1999年Goodell等人用肌肉来源的干细胞在小鼠体内分化成各种血细胞。这表明成体干细胞在一定的微环境的作用下，可以横向分化为需要的细胞和组织，从而起到极其有效的治疗作用人胚胎干细胞的性质能维持稳定、完整、正常的二倍体染色体结构；有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化；能参与胎儿所有组织的发育过程；胚胎干细胞的建系

一、来源从早期胚胎获得从移植细胞(克隆细胞)获得去核卵细胞+体细胞核

克隆

囊胚

分离内细胞群

ES细胞酶消化后培养免疫方法去除滋养层细胞流式细胞仪分离法胚胎干细胞的建系

二、分离原则：促进ES细胞的增殖保持ES细胞处于未分化状态胚胎干细胞的建系

三、培养(1)特殊的培养液：用DMEM培养液，其中胎牛血清的浓度和质量很重要，还要加非必需氨基酸；β-巯基乙醇;生长因子。(2)以人或胚鼠的成纤维细胞为饲养细胞。(3)必须加入LIF，抑制细胞分化胚胎干细胞的建系

四、鉴定形态：集落状生长，结构致密，细胞间界限不清。单个细胞体积小圆，核质比大。核型鉴定：二倍体核型。生化特征：端粒酶活性高物理特性：对Hoechst33324和Rhodamine123染料不着色。细胞内碱性磷酸酶活性高干细胞表面表达特异抗原：SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81人、猴、小鼠ES细胞的分子差异

表达Oct-4转录因子

能分化成三个胚层的细胞，将胚胎干细胞植入免疫缺陷小鼠皮下可产生畸胎瘤

嵌合体实验（1）加入诱导细胞分化的因子或化学物质，如VGEF、bFGF、DMSO和RA等（2）将ES细胞与特定的细胞共培养（3）将某种分化诱导因子的基因转入ES细胞内，触发ES细胞沿特定途径分化。胚胎干细胞的诱导分化胚胎干细胞的诱导分化matureneurons(red)andglialcells(green)鉴定分化后细胞的常用方法（1）细胞形态与结构（2）细胞功能（3）细胞表面的特殊标志（4）细胞内特异基因的表达造血干细胞的鉴定：（1）细胞形态：集落呈非贴壁生长，细胞形态较小（2）细胞表面标志：flk-1（FetalLiverKinase1);L/TAL-1；CD34；GATA-1；（3）基因表达：TAL-1；GATA-2；βH1；β主要珠蛋白

内皮细胞:（1）细胞形态：扁平贴壁状态；Weibel-Palade小体；广泛胞内连接；大量吞饮泡（2）细胞标志：血小板内皮细胞粘附分子PECAM-1或CD31；细胞粘附分子整合素αvβ3；CD34；JAM(JunctionalAdhesionMembrane)；MECA-32以及MEC-14，7抗原（3）特异基因表达：flk-1；flt-1；tie-2ConfocalmicroscopyofEBsstainedforPECAM1showingthree-dimensionalnetworkformations,vascular-likechannels.(A)4-day-oldEB.(B)6-day-oldEB.(C)10-day-oldEB.(D)13-day-oldEB心肌干细胞：（1）细胞结构：细胞内含糖原颗粒，大量线粒体以及广泛的未形成成熟肌原纤维的粗丝和细丝（2）细胞功能：节律性收缩；心肌特异离子流。利用膜片钳技术可检测L型Ica，Ina，Ito，Ik，Ik1，Ik，ACH和If（3）基因表达：α及β心肌球蛋白重链

神经干细胞:（1）细胞形态：胞体很小，从胞体伸出许多长的神经突（2）细胞功能：电压控制性Na+，K+，Ca2+通道；神经递质的受体（3）细胞标志：TH（酪氨酸羟化酶），微管相关蛋白tau，MAP2，β微管蛋白3（TuJ-1），GFAP（胶质原纤维酸性蛋白），巢蛋白，突触泡蛋白以及NF-L（68KDa的神经丝蛋白），NF-H（200KDa的神经丝蛋白），NF-M（160KDa的神经丝蛋白）；Nurr1和Ptx3（中脑多巴胺能神经元的标志）（4）特异基因表达：5天的EBs中有NF-L，NF-M和突触泡蛋白的表达，2天后表达编码神经聚糖（脑特异蛋白多糖）的基因，6天后表达编码微管相关蛋白tau的基因。也有检测发现分化细胞中有Brain-3，谷氨酰胺受体亚单位GluR-4和GluR-6，递质合成酶TH和GAD67，GAD65，GFAP和NF-L的表达

160kDaneruofilamentproteinnestinb-III-tubulinGFAP

胰岛细胞:细胞标志：GATA-4（胚胎和胚外内胚层的标志），HNF3β（胚胎内胚层的标志）；胰岛素淀粉样多肽IAPP；葡萄糖转运蛋白-2（Glut-2）；胰岛β细胞的特征及特定标记物：胰岛GK和GLUT2（葡萄糖转运子）；转录因子IPF1/PDX1和NgN3（Neurogenin3）

2002年3月，美国麻省理工学院的科学家宣布，他们首次利用人体胚胎干细胞培育出毛细血管，证明了胚胎干细胞技术在治疗心血管疾病等领域的应用潜力。目前已有报导ES细胞能在适当条件下分化为心肌细胞，胰岛细胞，血管内皮细胞，肝细胞等。Aftertransplantationintothebrainsofyoungmice,theneuralprecursorcellsgiverisetofunctioningneurons(redinA)andastrocytes(redinB),胚胎干细胞的研究意义为在细胞和分子水平研究人类早期胚胎发育过程提供良好的材料和方法，是基因功能研究的有限手段。用于新药的发现，筛选及安全性实验。重要的临床价值，可作为组织移植，细胞治疗和基因治疗的细胞来源。解决胚胎来源有限的途径：未成熟卵的体外成熟避免免疫排斥的方法（1）Knock-out胚胎干细胞的组织相容性抗原（2）Knock-in受者的组织相容性抗原（3）与同一来源的造血干细胞一同移植（4）受者的体细胞核移植

胚胎干细胞的来源是否符合法律与道德？

胚胎干细胞的应用是否会引起伦理及法律问题？

该项研究是否会导致人流泛滥？或导致医生刻意造成胚胎流产？

如何看待克隆人的研究？ThisismurderThisdevalueslife2001年8月，美国总统布什规定联邦政府对胚胎干细胞研究的资助仅限于研究当时已有的胚胎干细胞，不得资助从新胚胎中提取干细胞进而开展研究

NIH对现存人体胚胎干细胞系进行登记，认定世界上有64个人体胚胎干细胞系符合联邦政府资助的标准。64个人体胚胎干细胞系分布在6个国家的10个机构中：瑞典24个，美国20个，印度10个，澳大利亚6个，以色列4个。NIH试图用这些人体胚胎干细胞系完成有关人体胚胎干细胞的基础研究工作。2009年3月，奥巴马签署行政命令，宣布解除对用联邦政府资金支持胚胎干细胞研究的限制，实现他要把科学与政治分离的竞选承诺。NIH院长弗朗西斯·柯林斯2009年12月2日宣布，利用私人资金制成的13个人类胚胎干细胞系已获准用于该院资助的研究。这是美国总统奥巴马今年3月解除用联邦政府资金支持胚胎干细胞研究的限制以来，美国科研机构首次批准将人类胚胎干细胞系用于医学研究。“人们应该开香槟庆祝，干细胞研究恢复到一个正常的状态中去。”

ES细胞研究的趋势改善ES细胞的体外培养条件，建立更有效更简便的获得ES细胞的方法。定向诱导分化成特定类型细胞，用于临床疾病的治疗，并解决免疫排斥和潜在的致肿瘤的问题。成体干细胞的横向分化的能力以及与胚胎干细胞的比较，成体干细胞能否替代胚胎干细胞？如何绕过伦理问题开展新技术？胚胎干细胞全能性的蛋白网络Nature.2006;444(7117):364-8.SomaticcellSimilartoEScellAddtheabovekeyfactors?Induced

pluripotent

stem

cells2.用皮肤细胞培育胚胎干细胞

2007年11月，日本和美国小组小组报告说，他们成功地用人类皮肤细胞培养出了诱导性多功能干细胞。由于这项研究解决了胚胎干细胞研究所面临的伦理问题，因此将彻底改变干细胞研究的科学与政策，为生物医学研究开辟新的方向。

干细胞生物学与克隆

国家十分重视干细胞与克隆:国家在“十一五”期间，将“生殖与发育”作为四个重大科学研究计划之一

目前根据干细胞研究领域的最新研究成果，为我们未来的工作提供了重要的启示，科技部专家组正在讨论准备在“表观遗传学调控及生物学意义”或“生长发育的表观遗传调控”方面立项我国科学家首次利用iPS细胞发育成的具有生殖能力的小鼠“小小”

Nature2009每个人都能做iPS？是的，这已是事实。正如Thomson所说：“现在全世界都在做这个了每个人都可以拥有自己量身定做的细胞？幻想，除非你有钱快要引入临床治疗了？为时过早！

iPS细胞和胚胎干细胞是相同的？不管怎么说，到现在为止是的。Thomson说，只有时间有权利说话，但是我不知道我会向哪走。如果你不能说出iPS细胞和胚胎干细胞的区别，胚胎干细胞就会逐渐走出历史的舞台，他说。如果一切如他预言，这可能会是一个时代的结束。

iPS细胞不存在伦理问题？不一定，看你想做什么。Ya