牡丹叶对不同受体植物幼苗生长的影响

牡丹叶对不同受体植物幼苗生长的影响

牡丹是牡丹科的一种落叶灌木。它是重要的观赏植物和药物。其根皮为常用中药材,内含的丹皮酚具有抗血栓形成、抗动脉硬化、降血压、保护脑组织等多种药理作用。花瓣富含多酚、类黄酮与花色苷,具抗氧化活性和自由基清除能力。牡丹籽提取物Ⅱ(脂溶性成分)对枯草杆菌、沙门氏菌、根霉菌和黑曲霉菌均有一定的抑制作用。提取物Ⅲ(水溶性成分)对枯草杆菌、沙门氏菌和巴氏杆菌均有一定抑菌作用。叶中所含有的黄酮类化合物对大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和沙门氏菌(Salmonella)3种细菌均有较强的抑制作用。黄酮类化合物还具有抗氧化、清除自由基、消炎、调节血脂、抗癌、抗HIV等广泛的生物活性。罗小勇采用琼脂混粉法测定了牡丹不同器官粉末对生菜、黄瓜、反枝苋、苘麻、小麦和稗6种受体植物幼苗生长的影响,发现除茎器官外,其他各器官的粉末在10g/L的添加浓度下,对各受体植物幼苗的生长均具有明显的抑制作用,且对胚根或种子根的抑制效果明显高于对胚轴或胚芽鞘的抑制。各器官中以根和叶的效果最好,花、果实和叶柄次之,茎最低。除此之外,尚未见其他有关牡丹对植物幼苗具有抑制效应的报道。本研究选择活性最高的叶器官进一步测定了其粉末在不同浓度下对生菜、小麦、稗、黄瓜、夏至草、播娘蒿和独行菜等7种受体植物幼苗生长的影响,并探索了其不同溶剂提取物的抑制活性大小,以期为进一步开展植物源活性物质的提取分离及开发提供依据。1材料和方法1.1电动粉碎机制备牡丹叶于2011年5月采自青岛农业大学校园内。将其置阴凉处干燥后,用电动万能粉碎机(FW100型,转速24000r/min,天津市泰斯特仪器有限公司生产)粉碎1～2min,取过40目铁筛的粉末于低温冰箱(1℃)中保存备用。1.2cumeastivuml.生菜(Lactucasativavar.ramosaHort,抗热绿湖黑核西生菜特选种388,蔡兴利国际有限公司生产,美国)、小麦(TriticumaestivumL.,烟农24号)、黄瓜(CucumissativusL.,青研85F12)、稗[Echinochloaarusgalli(L.)Beauv.]、夏至草[Lagopsissupine(Steph.)IK.-Gal.exKnorr.]、播娘蒿[DescurainiaSophia(L.)Schur.]和独行菜(LepidiumapetalumWilld.)。杂草种子均采自青岛农业大学校园内。1.3测试方法1.3.1水提取液的制备称取30g牡丹叶粉末3份置于3个500mL三角瓶中,分别加入99.5%甲醇溶液、99.7%乙醇溶液和蒸馏水各300mL,充分摇匀使之全部润湿后置室温(20℃)下浸提,每隔3h搅拌1次,2d后过滤,收集滤液。而后按同样方法再提取2次。合并3次滤液,真空抽滤(Whatman,No2.)后于45℃下旋转蒸发,得到浸膏。水提取液置于45℃水浴锅内自然风干。针对乙醇溶剂还进行了0、20%、40%、60%、80%和100%不同溶剂浓度的提取试验。1.3.2牡丹花叶提取物的处理采用罗小勇提出的琼脂混粉法进行。将受体植物种子经0.2%次氯酸钠溶液浸泡15min后,用自来水冲洗数次并置流水下浸泡吸水3～5h(根据室内温度调整时间),而后用蒸馏水洗涤数次,均匀摆放于带盖方盘内的吸水纸上,滴加蒸馏水至种子不漂浮,遮光置于全智能人工气候箱(HP1000GS-B型,武汉瑞华仪器设备有限责任公司生产)内发芽,24～72h后胚根或幼根的长度将达到3～5mm。称取0.5g琼脂粉末分别置于250mL三角瓶内后加入94.5～99.5mL蒸馏水(根据所加样品的浓度调整水量),放入微波炉内加热至完全溶解后静置,待冷却至60℃时分别加入事先称好的牡丹叶粉末或不同溶剂提取物,然后分别均匀倒入3个小塑料杯内,冷凝,配制成含有不同浓度供试材料的0.5%琼脂凝胶,以未加供试材料的0.5%琼脂凝胶为对照处理。其中,叶粉末的供试浓度梯度分别为0、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0g/L,牡丹叶提取物的供试浓度梯度分别为0、0.05、0.25、0.5、2.5、5.0g/L。移植时先用尖嘴镊子在已凝固的琼脂表面插5个小孔,而后分别夹取胚根长度基本一致的已发芽指示植物种子,将胚根垂直由小口轻轻植入琼脂凝胶中。每杯5粒,重复3次。而后将所有杯子用锡纸封口并置于已消毒的小纸箱内,为防止光照对化合物及植物幼根生长的影响,将小纸箱放入人工气候箱遮光培养3～4d。人工气候箱的设置条件为:14h(25℃)光照和10h(20℃)黑暗的自动循环,箱内的相对湿度为60%。待处理结束后用电子游标卡尺分别测量受体植物幼苗胚根(种子根)和胚轴(胚芽鞘)的长度。按下式计算胚根(种子根)和胚轴(胚芽鞘)的实际生长量,应用EXCEL软件,以生长量为基数,分别计算不同浓度的牡丹叶粉末处理之后对指示植物胚根(种子根)和胚轴(胚芽鞘)生长的抑制率以及样本的误差。同时应用SPSS软件计算出有效中浓度(EC50),并以LSD法对获得的抑制率进行差异显著性分析。生长量=处理后的胚根(胚轴)长-处理前的胚根(胚轴)长抑制率(%)=(对照生长量-处理生长量)/对照生长量×1002结果与分析2.1不同浓度的牡丹叶粉末对七种受体植物幼苗的生长有影响2.1.1不同供试浓度对夏至草幼苗胚根和胚轴生长的影响表1所示为不同浓度牡丹叶粉末对双子叶植物幼苗生长的影响。可见,牡丹叶粉末对所有受体植物胚根和胚轴生长的抑制率随着供试浓度的增加而增大,且对胚根生长的抑制作用明显高于对胚轴的抑制。其中,对生菜而言,在0.625g/L的最低供试浓度下,幼苗胚根的生长就已经受到一定的抑制,抑制率为29.3%,而对胚轴的生长几乎没有影响。此后,随着供试浓度的增加,对胚根/胚轴生长的抑制率依次提高,在1.25、2.5、5.0、10.0g/L浓度下对二者的抑制率分别达到69.3%/21.6%、81.6%/31.3%、92.5%/45.7%和96.7%/67.4%,其中,除了两个高浓度对胚根的抑制及两个低浓度对胚轴的抑制差异不显著外,其余均达显著水平。计算对二者的EC50分别为0.93、5.25g/L。但对黄瓜幼苗胚根和胚轴生长的影响,0.625g/L的最低供试浓度下影响均不明显,抑制率分别仅为6.3%和4.8%。此后,随着供试浓度的增加,对胚根和胚轴生长的抑制率依次提高,在1.25、2.5、5.0、10.0g/L浓度下对二者的抑制率分别达到26.4%和12.9%、33.7%和16.3%、61.9%和23.1%、79.0%和29.0%,其中,对胚根的抑制除了两个低浓度之间差异不显著外,其余均达显著水平,对胚轴的抑制除3个高浓度之间、2个低浓度之间及1.25g/L和2.5g/L两浓度之间均不显著外,其余均达显著水平。计算对二者的EC50分别为3.58g/L和>10.0g/L。夏至草幼苗胚根和胚轴的生长在0.625g/L的最低供试浓度下均受到一定的抑制,抑制率分别为17.7%和14.4%。在1.25、2.5、5.0、10.0g/L浓度下则分别提高到66.4%和20.3%、85.8%和27.7%、95.1%和47.4%、97.4%和68.3%,其中,除了两个高浓度对胚根的抑制差异不显著,以及0.625、1.25g/L两浓度之间对胚轴的抑制差异不显著外,其余均达显著水平。计算对二者的EC50分别为1.09、5.27g/L。播娘蒿在0.625g/L的最低供试浓度下,其幼苗胚根和胚轴的生长不但没有受到抑制,反而显示出一定的促进作用。但在1.25g/L的供试浓度下,胚根的生长受到显著的抑制,抑制率达67.9%,对胚轴生长的影响则较轻微。此后,随着供试浓度的增加,对胚根和胚轴生长的抑制率依次提高,在2.5、5.0、10.0g/L浓度下对二者的抑制率分别达到87.3%和8.4%、96.3%和25.3%、97.1%和51.0%,其中,除了两个高浓度及两个低浓度对胚根的抑制差异不显著,以及1.25g/L浓度处理与空白对照对胚轴的抑制差异不显著外,其余均达显著水平。计算对二者的EC50分别为1.02g/L和9.65g/L。独行菜在0.625g/L的最低供试浓度下,只有胚根的生长受到明显的抑制,抑制率为31.4%,而胚轴的生长则受到轻微的促进。此后,随着供试浓度的增加,对胚根和胚轴生长的抑制率依次提高,在1.25、2.5、5.0、10.0g/L浓度下对二者的抑制率分别达到77.2%和9.9%、94.2%和31.9%、96.8%和45.5%、98.7%和55.2%,其中,3个高浓度下对胚根的抑制差异不显著,对胚轴的抑制差异在2个高浓度和3个低浓度下均不显著,其余均达显著水平。计算对二者的EC50分别为0.79g/L和6.84g/L。2.1.2供试浓度对胚芽剑生以小麦和稗为单子叶受体植物测定了牡丹叶粉末在不同浓度下对幼苗生长的影响,其结果见表2。可见,与上述双子叶受体植物一样,它们的幼苗生长也受到了显著的抑制,抑制作用随供试浓度的增加也明显提高,且对种子根的抑制作用明显高于对胚芽鞘的抑制。小麦在0.625g/L的最低供试浓度下,只有种子根的生长受到明显抑制,抑制率为28.0%。此后,随着供试浓度的增加,对胚芽鞘的生长也显示出明显的抑制,在1.25、2.5、5.0、10.0g/L浓度下对种子根和胚芽鞘的抑制率分别达到55.3%和29.1%、74.1%和42.7%、81.2%和52.3%、87.4%和60.8%,除两个低浓度对胚芽鞘的抑制差异不显著外,其余均达显著水平。计算对二者的EC50分别为1.20g/L和4.65g/L。稗幼苗种子根和胚芽鞘的生长在0.625g/L的最低供试浓度下均受到显著的抑制,抑制率分别为39.0%和20.6%。此后,随着供试浓度的增加,对二者生长的抑制率依次提高,在1.25g/L、2.5g/L、5.0g/L和10.0g/L浓度下抑制率分别达80.6%和39.4%、88.3%和50.3%、91.2%和56.4%、96.5%和62.6%,除2.5g/L和5.0g/L两浓度之间对种子根的抑制差异不显著外,其余均达显著水平。计算对二者的EC50分别为0.64g/L和3.36g/L。2.2种溶剂提取物对生姜幼苗胚根和胚轴的抑制效果表3所示为牡丹叶不同溶剂提取物对生菜幼苗生长的影响。可见,尽管在低浓度下,各溶剂提取物对生菜幼苗生长的影响有所差异,但在高浓度下,均显示出较高的抑制作用,尤其是乙醇和甲醇提取物。在2.5g/L和5.0g/L浓度下,3种溶剂提取物对生菜幼苗胚根和胚轴的抑制率,乙醇为94.2%和54.4%、97.2%和69.3%,甲醇为94.5%和49.1%、97.0%和61.3%,蒸馏水为77.2%和11.3%、89.5%和29.3%。计算EC50分别为0.25g/L和1.56g/L、0.44g/L和2.74g/L、0.82g/L和>5.0g/L。2.3牡丹花叶片提取物对种子生长和胚轴抑制率的影响根据上述结果,选择提取物活性最高的乙醇作为提取溶剂进行了不同提取浓度试验,其结果见图1。可见,用20%、40%、60%、80%和100%乙醇溶液处理牡丹叶片粉末所得到的提取物对生菜幼苗胚根生长的抑制率均较高,依次为92.5%、97.6%、98.0%、99.1%和97.7%,而对胚轴的抑制率相对较低,依次分别为31.2%、47.3%、53.7%、63.5%和69.7%。3不同受体植物幼苗生长的差异许多研究表明,植物在生长过程中会产生许多具有植物化感活性的物质,当这些物质通过淋溶、挥发、根系分泌或残株分解进入周围环境后,会对其他植物或自身的生长产生影响。但不同植物间、同一植物的不同器官间化感作用的大小有着较大的差异。牡丹也不例外,各器官在10g/L的处理浓度下,对生菜、小麦等多种受体植物幼苗的生长都表现出较高的抑制活性,即化感活性,且以根和叶的效果最好,这是国内外牡丹对植物幼苗生长具有抑制活性的首次报道。本研究在此基础上进一步测定了其叶器官粉末在不同浓度下对生菜、小麦、黄瓜、稗草、夏至草、播娘蒿和独行菜等7种受体植物幼苗生长的影响,发现不同受体植物的敏感性存在较大差异,呈现出一定的选择性。其中,以稗的敏感性最强,抑制其种子根和胚芽鞘生长所需的有效中浓度(EC50)分别只有0.64g/L和3.36g/L,而黄瓜的敏感性最低,抑制其幼苗胚根和胚轴生长所需的EC50分别为3.58g/L和>10.0g/L,其他植物的敏感性则介于稗与黄瓜之间。稗、播娘蒿、独行菜、夏至草都是常见的农田杂草,其中,稗和播娘蒿更是危害小麦等多种作物的恶性杂草,牡丹叶对几种杂草所表现出的高抑制活性说明该器官中可能含有可供除草剂开发的活性物质。为了进一步提取分离这些高活性物质,本研究以提取物对植物幼苗生长的抑制活性大小为指标,探索了不同溶剂提取物的抑制效果,发现乙醇和甲醇提取物对生菜幼苗生长的抑制活性高于蒸馏水提取物的抑制效果,而两种有机溶剂之间以乙醇的抑制效果较高。因而,选择乙醇为提取溶剂,进一步测定了其最佳提取浓度,发现在10.0g/L的供试浓度下,以80%乙醇溶液提取物对生菜幼苗生长的抑制活性最高。这些结果为牡丹叶中活性物质的进一步提取分离提供了重