苦瓜多糖脱蛋白方法的比较研究

苦瓜多糖脱蛋白方法的比较研究

杏仁是甘薯科的一种水果。它具有良好的食用价值和明显的药物功能，被称为“植物”。苦瓜多糖作为苦瓜中含量较高的生物活性物质之一,引起了人们的极大兴趣和广泛关注。研究表明,苦瓜多糖具有降血糖、降血脂、抗肿瘤和提高人体免疫力的功效。天然植物中的多糖与蛋白质2种高分子成分往往共存,且常结合形成糖蛋白复合物,因此从粗多糖中脱除蛋白质较为困难。另外,植物多糖一般采用热水浸提-乙醇沉法提取,所得粗多糖含较多游离的蛋白质,这对苦瓜多糖的分离纯化带来了很大的影响,不利于进一步对苦瓜多糖的结构及其生物活性的研究。因此,寻找一种尽可能多地除去苦瓜粗多糖中的蛋白质且有效保留多糖成分的方法已成为了一个突出的问题。对此,笔者就几种脱蛋白方法进行了比较研究,探索了苦瓜多糖最佳脱蛋白工艺;并测定了脱蛋白前后苦瓜多糖的紫外光谱特性,以期为苦瓜多糖的开发利用提供一定的理论基础。1材料和方法1.1试验材料1.1.1牛血清蛋白、考马斯亮蓝g-25、葡萄糖标准品苦瓜,购于韶关农贸市场;木瓜蛋白酶(sigma公司)、牛血清蛋白(sigma公司)、考马斯亮蓝G-250、葡萄糖标准品;三氯乙酸、盐酸、浓硫酸、蒽酮、氨水、三氯甲烷、磷酸、正丁醇、无水乙醇、乙醚、丙酮等均为国产分析纯。1.1.2仪器、仪器和仪器721型紫外可见分光光度计,上海第三分析仪器厂;FA1104电子天平,上海精天电子仪器厂;DK-8D数显电热恒温水槽,上海森信实验仪器有限公司;EYELAN-1000旋转蒸发仪,日本东京理化器械株式会社;ZK-828型电热真空干燥箱,上海跃进医疗器械厂。1.2测试方法1.2.1提取液用量的提取苦瓜多糖的提取和制备参照文献进行。称取已干燥的苦瓜粉末10g,置索氏提取器中,加入石油醚100ml,90℃回流提取1h脱脂,抽滤,滤渣经挥干溶剂后,加入200ml80%乙醇于90℃下回流1h,过滤,离心。上清液浓缩至20ml,加入无水乙醇使醇沉浓度达80%,于4℃冰箱中醇沉过夜,离心,取沉淀,并依次用无水乙醇、丙酮、乙醚各洗涤2次,真空干燥至恒重,即得苦瓜粗多糖,备用。1.2.2脱蛋白质法(1)veing试剂苦瓜粗多糖溶液(50ml)以体积比1∶5加入Seveage试剂,混合物剧烈振摇15min离心(4000r/min,5min),除去水层和溶液层交界处的变性蛋白质。反复进行至无蛋白层,得到脱蛋白液。(2)脱蛋白液的制备苦瓜粗多糖溶液(50ml)用10%三氯乙酸调节其pH值至3,室温下放置过夜,离心(4000r/min,5min),弃去沉淀,反复进行直至无沉淀,得到脱蛋白液。(3)西瓜蛋白酶脱蛋白液的制备苦瓜多糖溶液(50ml),调pH值至6.5,60℃下放置1h后,用1.25%(V/V)的木瓜蛋白酶55℃恒温5h后,离心(4000r/min,5min),得到脱蛋白液。(4)西瓜蛋白酶脱蛋白液的制备苦瓜多糖溶液(50ml),调pH值至6.5,60℃下放置1h后,用1.25%(V/V)的木瓜蛋白酶55℃恒温5h后,离心(4000r/min,5min),得上清液,上清液再经Seveage法脱蛋白,反复进行3次至无蛋白层,得到脱蛋白液。(5)脱蛋白液的制备苦瓜粗多糖溶液(50ml)+1mol/L盐酸溶液,调pH值至3,4℃下放置12h后,离心(4000r/min,5min),得到脱蛋白液。1.2.3测试(1)测定了蛋白质含量以牛血清蛋白为标准品,采用考马斯亮蓝G-250测定。(2)测定了杏仁的糖含量以葡萄糖为标准品,采用蒽酮-浓硫酸法测定。测定脱蛋白后各多糖溶液中多糖含量、蛋白质含量,然后计算蛋白清除率和多糖损失率。2结果与分析2.1标准曲线的绘制蛋白质的测定方法有紫外分光光度法、Lowry法、双缩脲法和考马斯亮蓝法。考虑考马斯亮蓝法具有使用方便、反应时间短、染色稳定、抗干扰性强等特点,笔者选用其作为蛋白质的测定方法。考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后变为青色,其结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。以牛血清蛋白为标准品,做标准曲线,求得回归方程。标准曲线见图1。标准曲线的回归方程为Y=0.0052X-0.0023,R2=0.9972,由图1可见,标准品在0～100μg/ml范围内呈良好的线性关系。此法试剂配制简单,操作简便快捷,反应灵敏,适合苦瓜粗多糖溶液中蛋白质含量的定量分析。2.2操作次数对多糖去除率和多糖损失率的影响由于苦瓜粗多糖中蛋白质含量高,Seveage法脱蛋白过程中需反复处理1～6次,分别测定每次脱蛋白粗多糖溶液中的蛋白及多糖含量,结果见图2。由图2可见,随着操作次数的增加,蛋白质去除率也增加,3次后,蛋白质去除率即可达到50%以上;但操作次数的增加也会导致多糖的损失,3次后多糖损失率已达50%,其原因是每次除去蛋白质变性胶状物时,不可避免地裹胁了部分多糖,另外那些与蛋白质相结合的蛋白聚糖和糖蛋白在处理时也可能会沉淀下来,从而造成了多糖损失。因此,采用Seveage法除蛋白,反复处理5次时,脱蛋白效率相对较高,但多糖损失率也较高,要将其控制在较理想的范围较为困难。2.3果汁多糖的脱蛋白试验结果酶法脱蛋白是利用酶的作用使蛋白质变性沉淀而分离。分别添加浓度为0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%和2.00%(V/V)的木瓜蛋白酶于苦瓜粗多糖溶液中,测定脱蛋白后的蛋白质去除率和多糖损失率。木瓜蛋白酶法脱蛋白的试验结果见图3。由图3可知,随着木瓜蛋白酶浓度的升高,蛋白质去除率明显增加,但是当用量达到1.25%后,蛋白质去除率效果变化不明显,此时其蛋白质去除率约为50%;另一方面,木瓜蛋白酶浓度对多糖损失影响不大,损失率均较低,最高时仅为11.6%。综合考虑,选择木瓜蛋白酶的用量为多糖体积的1.25%较为合理。2.45果汁蛋白脱除率及多糖损失率该试验对盐酸法和三氯乙酸法脱蛋白效果进行了研究,其脱蛋白率和多糖损失率见图4。由图4可知,5种方法对苦瓜粗多糖提取液中蛋白质的脱除效果存在明显差别,脱除率由大到小依次为:Seveage法(操作6次)>酶+Seveage法>盐酸法>三氯乙酸法>酶法。Seveage法与酶+Seveage法在蛋白质脱除率方面的差别不大,都达到75%以上。5种方法中多糖损失率由低到高依次为:三氯乙酸法<酶法<酶+Seveage法<盐酸法<Seveage法。由此可见,盐酸法脱蛋白效果较好,但多糖损失率仍较高(48.2%)。此外,盐酸为强酸,若实验条件未得到严格控制,经盐酸脱蛋白后,部分多糖很可能会降解。Seveage法脱蛋白,需要重复进行多次才能有较好的脱除效果,经6次处理后,蛋白质去除率达78.8%,而多糖损失率也高至60.8%。三氯乙酸作为一种有机酸,能使蛋白质变性沉淀,以达到脱除蛋白质的目的,但蛋白质去除率不高,仅50.8%。采用酶法和Seveage法结合使用的方法,既可以有效地脱除蛋白质,又能较好地保留多糖。经木瓜蛋白酶处理后,绝大部分游离蛋白质及部分与多糖结合的蛋白质被水解,因此多糖沉淀中蛋白质的含量大为降低,且酶解后只需用Seveage试剂处理1～2次即可将蛋白质有效除去,从而能减少多糖的损失。因此,酶和Seveage相结合法是比较理想的脱蛋白方法。2.5紫外-可见吸收光谱采用酶法和Seveage法结合脱蛋白。取脱蛋白前后的粗多糖在200～400nm做紫外-可见吸收光谱扫描,结果见图5。由图5可知,未经除蛋白处理的苦瓜粗多糖溶液在280nm处有明显的蛋白特征吸收峰,而脱蛋白后在280nm处无特别明显吸收峰,说明酶法和Seveage法结合脱蛋白的效果显著。3脱蛋白法或酶法近年,植物多糖的药理作用逐渐被人们所认识。但是,在研究植物多糖过程中,植物蛋白常影响植物多糖纯度,以致其药理研究出现较大差异。所以多糖脱蛋白是多糖纯化的关键。该试验结果表明,在Seveage法脱除蛋白质过程中,蛋白质与糖的变化趋势相同。在脱除蛋白质的同时,多糖中的糖随之损失,蛋白质和糖损失变化趋势十分相似。此外,Seveage法脱蛋白使用的试剂是氯仿和正丁醇,而氯仿是有毒物质,容易造成多糖活性下降和溶剂残留,可能影响其生物活性的研究,此方面仍需深入研究。值得注意的是,无论采用哪种脱蛋白方法,所得的多糖制品中都仍存在着20%以上的蛋白质成分。这可能