微生物学第四章 酶的分离纯化

第四章酶的分离纯化及产品成型9/22/2023第四章酶的分离纯化及产品成型重点（2）酶的分离纯化：沉淀分离、离心分离、膜过滤、层析分离、电泳分离（4）酶纯化过程的纯度监测本章知识点：（1）细胞的破碎、酶的提取（3）酶液的浓缩、结晶、干燥、成型一、生物下游加工技术下游加工过程包括目标产物的提取、浓缩、纯化及成品化等过程。

大多数酶的回收纯化过程成本约占70%；

医用酶的生产回收过程的成本高达85%；

基因工程表达产物的回收纯化过程成本一般占85-90%以上；

青霉素回收过程成本约占50%；

乙醇的回收过程成本仅占14%。二、分离纯化的一般流程发酵液细胞分离（离心、过滤）细胞清液细胞破碎碎片分离粗分离纯化成品化线路2线路1（胞内酶）（胞外酶）预处理发酵液预处理细胞分离细胞破碎细胞碎片分离初步分离纯化成品加工（胞外酶）人干扰素是一种重要蛋白类生物药品，具有抗癌和治疗肝炎等作用。Yonehara等人：醋酸锌盐析离子交换层析硫酸铵盐析铜螯合层析疏水层析凝胶电泳staehelin等人：硫酸铵盐析免疫亲和层析阳离子交换层析（83.0%）（62.7%）（96.2%）（46.0%）（78.3%）（88.9%）共六步，总收率仅为16%仅三步，总收率达81.0%首先，应对被纯化的酶的理化性质有一个比较全面的了解;其次，判断采用的方法和条件是否得当，始终以活力回收率和纯化倍数为指标；再者，在纯化工作中，往往不宜重复采用相同的步骤和条件；最后，要严格控制操作条件。在实践工作中选择方法时:酶分离纯化方法离心分离、凝胶过滤、膜分离盐析沉淀、有机溶剂沉淀、共沉淀、等电点沉淀离子交换层析、电泳分离、等电聚焦选择性热变性法、选择性酸碱变性法、选择性表面变性法亲和层析、免疫电泳、免疫沉淀分离依据的性质分离方法分大小、轻重溶解度大小稳定性差异电荷性质亲和作用发酵液预处理细胞分离细胞破碎细胞碎片分离初步分离纯化成品加工（胞外酶）第一节酶的提取分离（酶溶液的制备）方法：（1）加热

适用于耐热的酶，加适当的酶保护剂。

（2）加凝聚剂或絮凝剂

（3）调pH值一、发酵液的预处理目的：降低粘度，便于固液分离。发酵液预处理细胞分离细胞破碎细胞碎片分离初步分离纯化成品加工（胞外酶）二、细胞破碎—只对胞内酶（1）机械破碎法（2）物理破碎法（3）化学破碎法（4）酶促破碎法超声波细胞破碎机细胞破碎珠高压细胞破碎机电动玻璃匀浆机利用机械力的搅拌，剪切或研碎细胞。组织捣碎机，细胞研磨器，匀浆器等。（一）机械破碎法高压匀浆器细胞悬浮液加工后的细胞匀浆阀座碰撞环阀杠珠磨机通过温度，压力，声波等各种物理因素的作用，将组织细胞破碎的方法。冻融法、压差法、超声波法。（二）物理破碎法通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎的方法。有机溶剂：如甲苯，丙酮，丁醇，氯仿等。

非离子型表面活性剂：吐温、催通等。（三）化学破碎法微生物种类酶细菌酵母霉菌植物细胞（四）酶促破碎法（1）自溶法（自身酶）（2）酶处理（外加酶）溶菌酶β-葡聚糖酶几丁质酶纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶机械破碎捣碎法研磨法匀浆法物理破碎温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法化学破碎有机溶剂表面活性剂酶促破碎自溶法外加酶法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏细胞破碎方法及其原理三、酶的提取指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程，又称抽提。原料溶剂酶（一）提取方法四稀：稀盐、稀酸、稀碱、稀有机溶剂，水。提取方法提取对象稀盐溶液稀酸溶液稀碱溶液稀有机溶剂在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶在稀酸溶液中溶解度大且稳定的酶在稀碱溶液中溶解度大且稳定的酶与脂质结合牢固或含较多非极性基团的酶（二）提取过程中的注意事项不超出酶的酸碱稳定范围；最好远离待提取酶的等电点。0~10℃左右，尤其是采用有机溶剂提取时。3、提取液体积（用量）：为含酶原料体积的2~5倍。可一次抽提，也可分几次反复抽提。提高酶的稳定性。1、pH值：2、温度：4、加保护剂：第二节酶的沉淀分离、离心和膜过滤技术盐析沉淀法√有机溶剂沉淀法等电点沉淀法聚乙二醇沉淀法复合物沉淀法一、沉淀分离法（一）盐析沉淀法常用中性盐：（NH4）2SO4

优点：①溶解度大，温度系数小；②价廉易得；③可保护酶。1、盐析操作（1）硫酸铵的饱和度×100%（NH4）2SO4的饱和度（%）=实际浓度饱和浓度0.4S=40%（饱和度）（2）调整盐浓度的方法加饱和（NH4）2SO4溶液：VV0（S2-S1）1-S2=V0—原来溶液的体积V—所需加入饱和硫酸铵的体积S1—原来溶液的硫酸铵饱和度S2—所需达到的硫酸铵饱和度例：将2升0.2S的硫酸铵溶液提升至0.5S，需加饱和硫酸铵溶液多少升？溶液体积增加多少倍？加固体（NH4）2SO4：WB（S2-S1）1-AS2=W—将1L饱和度为S1的溶液提高到S2所要添加的固体硫酸铵克数；A、B—与温度有关的经验常数例：某酶制剂厂生产蛋白酶发酵液20吨，要求硫酸铵的饱和度达到40%，计算需要加入硫酸铵多少kg?（25℃）经验常数0℃10℃20℃25℃30℃A0.2710.2810.2900.2940.298B（g/L）514.72525.05536.34541.24545.88（mol/L）3.093.974.064.104.13①加入饱和硫酸铵溶液溶液体积不大，要达到的盐浓度不高②加入固体硫酸铵当溶液体积较大，要达到的盐浓度又较高2、为了得到较好的盐析效果，应控制下列因素：（1）不同酶，盐析时所需的盐浓度各不相同。（2）加盐操作时，防止局部盐浓度过高，防止产生泡沫。（3）pH值和温度：等电点附近，室温或低温操作。（5）脱盐：超滤、透析或层析。（4）蛋白质浓度：一般控制在2.5~3.0%为宜。（二）有机溶剂沉淀法1、作用原理

①去水膜；②降低介电常数；③破坏氢键。2、操作注意

低沸点，易燃易爆；低温操作，沉淀析出后要尽快分离。（三）等电点沉淀1、原理2、实际操作与其他方法一起使用（盐析、有机溶剂沉淀、复合沉淀）。单独使用时，主要是用于从粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白。3、注意加酸碱调节pH值时，防止局部酸碱过高。（四）选择性变性沉淀法1、热变性法：根据目的酶与杂蛋白热稳定性差异，可以在较高温度下，使杂蛋白变性沉淀，而酶则保持可溶状态。2、酸碱变性法：目的酶与杂蛋白的酸碱稳定性不同，可以调整pH使杂蛋白变性沉淀。

选择一定的条件使酶液中存在的某些蛋白质等杂质变性沉淀，而不影响所需的酶。第二节酶的沉淀分离、离心和膜过滤技术盐析沉淀法√有机溶剂沉淀法等电点沉淀法选择性变性沉淀法第二次作业：1、设计一套详细方案，从自然界中筛选产蛋白酶的微生物菌种。二、膜过滤技术在酶分离纯化中的应用借助于一定孔径的半透膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术。二、膜过滤技术在酶分离纯化中的应用膜分离技术已被国际上公认为20世纪末至21世纪中期最有发展前途，甚至会导致一次工业革命的重大生产技术，所以可以称为前沿技术，是世界各国研究的热点。广泛应用于生物工程、化学、制药、饮料、电力、冶金、海水淡化、资源再生等领域。渗出液膜分离技术的地位和影响