第7章 性质与分离纯化2010

第7章蛋白质的分离、纯化和表征一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质分子的大小与形状三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀四、蛋白质分离纯化的一般原则五、蛋白质的分离纯化方法六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定本章重点蛋白质分离基于蛋白质的哪些性质？主要纯化方法的原理？大概能够针对蛋白质的性质的差异设计相应的实验方案对蛋白质进行分离一蛋白质的酸碱性质1.蛋白质分子的可解离基团2.等电点：在某一pH,蛋白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，静电荷为零，这一pH称谓蛋白质的等电点蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。蛋白质所带电荷性质取决于可解离基团的种类和数目以及溶液的pH。每种蛋白质都有它特有的等电点，这也是鉴别蛋白质的指标之一。蛋白质的酸性氨基酸和碱性氨基酸含量与等电点的关系:等电点和蛋白质分子中所含氨基酸的种类和数目有关。3.等离子点蛋白质的等电点在有中性盐存在下可以发生明显的变化。Ca2+，Mg2+，Cl-，SO42-等离子点是蛋白质在没有其它盐类干扰的纯水中，蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的溶液的pH值。等离子点是一个特征常数。（一）根据化学组成（二）渗透压法（三）蛋白质的扩散和扩散系数（四）沉降分析法（五）凝胶过滤法（六）SDS二、蛋白质分子的大小和形状

(一）根据化学组成测定用化学的方法测定出蛋白质中某一微量元素的含量,并假设蛋白质分子中只含有一个该原子,则可以换算出蛋白质的最低相对分子质量:

元素的原子量元素的百分含量＊100最低相对分子质量=（五）凝胶过滤法测定相对分子质量

Note：蛋白质分子通过凝胶柱的速度并不直接取决于分子质量，而是分子的半径。因此用凝胶过滤法测定分子质量，标准蛋白质（已知Mr）与待测蛋白质必须具有相同的分子形状（球形）分子形状为线形或能与凝胶发生吸附作用的蛋白质，不能用此法测定。将已知分子质量的标准物质，在同一凝胶柱上以相同条件进行过滤层析，在一定的范围内，各个组分的Ve与其分子量的对数成线性关系。

Ve＝－b’lgMW＋c’优点：设备简单，不要求复杂的仪器对待测样品的纯度要求不高。待测样品可以是不纯的，只要他具有专一的生物活性。聚丙烯酰胺凝胶：具有三维网状结构和分子筛性质。以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳普通蛋白质电泳的泳动速率取决于荷质比（净电荷、大小、形状）（六）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）

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SDS在蛋白质表面均匀附上一层负电：

SDS（十二烷基磺酸钠），它能够与蛋白质多肽链中的氨基酸残基按大约1

1.4比例结合。

SDS可将蛋白质解离成亚基，所以测出的分子量是亚基的分子量。SDS－PAGE的依据：各种物质分子量的差异性。当SDS与蛋白质结合后。。。1)SDS使蛋白质分子即带有大量的负电荷，掩盖了蛋白质分子间的电荷差别2）改变了蛋白质单体的构象，SDS-蛋白质复合体形状趋向一致，所以各种SDS一蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，就反映了分子量的差异。

方法：①用SDS和巯基乙醇（打开二硫键）处理蛋白质变性（肽链伸展）并与SDS结合，形成SDS-蛋白质复合物，使得不同蛋白质分子均带负电（SDS带负电），且荷质比相同；不同蛋白质分子具有相似的构象。②用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的迁移率作图③测出待测样品的迁移率④从标准曲线上查出样品的相对分子质量分子量测定三蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀

蛋白质溶液中，蛋白质分子的直径介于1～100nm，该分散系统为胶体溶液系统。布郎运动、丁道尔现象、不能透过半透膜）。胶体系统保持稳定的三个因素颗粒大小在1～100nm范围内颗粒表面带有同种净电荷与水形成水化层（一）胶体性质

由于蛋白质分子很大，在水中形成胶体溶液。蛋白质主要是指球状蛋白质，它的亲水基团都在表面，因此与水有很大的亲和力，成为亲水胶体。蛋白质的亲水胶体溶液是相当稳定的，一方面由于蛋白质表面的亲水基团会吸引它周围的水分子，使水分子定向排列在它的周围，形成“水化层”。另一方面由于蛋白质在非等电点时带有同种电荷，与周围的反离子构成稳定的“双电层”，同种电荷相斥，也使蛋白质分子保持一定的距离而不会聚合。稳定亲水胶体的因素：

水化膜 表面电荷

当破坏了维持蛋白质胶体稳定的因素甚至蛋白质的构象时，蛋白质就会从溶液中析出，这种现象称为蛋白质的沉淀。应用:(1)蛋白质分离纯化(2)解毒(3)临床检验（二）蛋白质的沉淀

+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化层++++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用

蛋白质的聚沉蛋白质胶体溶液沉淀作用示意图(1)盐析法(saltingout)向蛋白质溶液中加入大量中性盐使蛋白质沉淀称为盐析。常用的中性盐：不破坏蛋白质的构象，蛋白质不发生变性。硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等使蛋白质沉淀的方法概念：特点：作用原理:盐离子与水亲和力极强，脱去蛋白水化层而聚集沉淀(2)有机溶剂沉淀法使蛋白质脱去水化层,又能降低溶液的介电常数，使蛋白质表面电荷减少，导致蛋白质分子聚集而沉淀。

必须在低温下操作注意事项:尽量缩短处理的时间

及时将蛋白质中残存的有机溶剂除去甲醇、乙醇、丙酮缺点：原理:常用有机溶剂:常会使蛋白质变性重金属离子如Cu2+、Hg2+、Ag2+、Pb2+等带有正电荷，能与蛋白质分子中带负电的基团结合，生成不溶性的重金属蛋白盐而沉淀。(3)重金属盐沉淀法此法常使蛋白质变性失活。若溶液pH大于蛋白质的pI，沉淀更易发生缺点：原理:生物碱试剂(如鞣酸、苦味酸、钨酸等)，某些酸类(主要是指三氯醋酸、磺酰水杨酸和硝酸等)，与带正电的蛋白质结合生成不溶性的盐而沉淀。(4)生物碱试剂和某些酸类沉淀法反应溶液的pH<pI，确保蛋白质以阳离子形式存在

缺点：原理:常引起蛋白质变性注意事项:（5）加热变性几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全，最迅速？？蛋白质天然结构解体，疏水基外露，破坏了蛋白质的水化层破坏电荷情况五蛋白质的分离纯化方法

分离提纯蛋白质的各种方法主要是利用蛋白质之间的各种特异性的差异，包括：（1）分子大小；（2）溶解度；（3）电荷不同；（4）选择性吸附；（5）对配体分子的生物学亲和力等。（一）根据分子大小不同的纯化方法

1透析(dialysis)和超滤(ultrafiltration)2密度梯度离心(densitygradientcentrifugatation)3凝胶过滤(gelfiltration)

不同分子量的蛋白质分子1透析和超滤*透析(dialysis)利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋白质大分子与其他小分子物质分开的方法。*超滤法

应用正压或离心力，使水和其他小分子通过半透膜而蛋白质被截留在膜上，达到浓缩或脱盐\粗分级的目的。透析与超过滤简易装置超滤装置2密度梯度离心原理：蛋白质在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的蛋白质颗粒比质量和密度小的蛋白质沉降的快，且每种蛋白质颗粒沉降至与其自身密度相等的介质梯度时，即停止不前，最后各种蛋白质就在离心管中被分离成各自独立的区带，从而得到分离。

沉降的速度与颗粒的重量、密度和形状有关。离心后按其沉降的速度不同，彼此分开形成区带。再进行光学定位，针刺或冰冻切片采样分析蔗糖密度梯度聚蔗糖密度梯度（1）凝胶过滤的介质3凝胶过滤凝胶的网孔大小决定分离范围能被该凝胶分离开来的蛋白质混合物的相对分子质量范围SephadexG-501500~30000常用的凝胶:葡聚糖凝胶（商品名Sephadex）聚丙烯酰胺凝胶(商品名Bio-GelP)琼脂糖凝胶(Sepharose，Bio-gelA)交联葡聚糖凝胶

Sephadex琼脂糖凝胶

Sepharose以甲叉双丙烯酰胺为交联剂，将丙烯酰胺（单体）聚合而成聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gelP）(2)凝胶过滤的原理床体积（Vt）膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积（Vt）

外水体积（Vo）：凝胶珠孔隙的水相体积内水体积（Vi）:凝胶珠内部的水相体积

基质体积（Vm）：基质自身具有的体积

洗脱体积（Ve）：自加样开始到该组分的洗脱峰出现时所流出的体积。

关系：Vt＝Vo＋Vi＋Vg

由于Vg相对很小，可以忽略不计，则有：

Vt＝Vo＋Vi物质在凝胶层析柱被排阻的范围均在均在0～100％之间，被排阻的程度由可用分配系数Kav表示Kav:分离化合物在内水和外水体积中的比例关系Kav＝Ve－V0／Vt－V0分离物分子质量大，Kav值小，反之，则增大

Ve一般是介于Vo和Vt之间的。对于完全排阻的大分子，洗脱体积Ve＝Vo，Kav=0；对于完全渗透的小分子，洗脱体积Ve＝Vt，Kav=1；分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之间，0<Kav<1。Kav既是判断分离效果的参数，又是测定蛋白质分子量的重要依据。（二）根据溶解度差别纯化的方法

影响蛋白质溶解度的外界因素主要有：（1）溶液的pH，（2）离子强度[I]，（3）介电常数ɛ，（4）温度T。根据蛋白质分子结构的特点，适当改变上述外界因素，就可以选择性的控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度，作为分离纯化蛋白质的一种手段。1.等电点沉淀和pH控制

2.盐溶和盐析

盐溶(saltingin)指的是低浓度的中性盐可以增加蛋白质溶解度的现象。盐析(saltingout)指的是当中性盐的离子强度增加到足够高时，（如饱和或半饱和的程度），很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来的现象。

常用盐析盐类：

(NH4)2SO4，NaCl等盐溶原理示意图盐析原理示意图应用

盐析是一种最常用的分级分离的方法之一,利用好了一步即能除去大量的杂蛋白.现在已有的很多蛋白水解酶或其酶原都已经利用盐析进行了沉淀并结晶,如:胰凝乳蛋白酶原,胰蛋白酶等优点:保持蛋白质的天然构象,能再溶解下面以卵清蛋白的分离为例看:鸡蛋清球蛋白沉淀滤液卵清蛋白晶体半饱和(NH4)2SO43.有机溶剂分级法

与水互溶的有机溶剂（如乙醇和丙酮）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低，

原因之一是降低了介质的介电常数，蛋白质表面的离子化程度减弱，水化程度降低，因此促进了蛋白质分子的聚集沉淀；

原因之二与盐析相似，有机溶剂与蛋白质争夺水化水，致使蛋白质聚集沉淀。

有机溶剂分级分离原理示意图4温度对溶解度的影响

在低离子强度时，蛋白质的溶解度大多数在一定范围（约0-40℃）内是随着温度增加而增加的。但在40-50℃以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性，一般在中性介质中就会失去溶解力。大多数蛋白质在低温下比较稳定。因此，蛋白质的分级分离操作一般都要求在低温下进行。（三）根据电荷不同的分离方法

1.电泳电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。分子大小不同的蛋白质所带净电荷密度不同，迁移率不同，在电泳时可以分开。

F=FfqE=fVµ=v/E泳动度电泳的发展a.自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。b.区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。1）纸电泳：用滤纸作支持物。2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。ProteinDenaturedPartialDenatured滤纸电泳

Cellulose薄层电泳(TLE)Celluloseacetate胶体

Starch→Gel■

电泳形式的演进圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。平板电泳：铺有凝胶的平板上进行的电泳。+—-+纯化中应用最多的是聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳，它们既可以作为蛋白质纯度检验方法，也可以纯化、制备蛋白质。（1）PAGE：PAGE电泳：以聚丙烯酰胺凝胶为支持介质的电泳凝胶板分为两部分：浓缩胶分离胶PAGE垂直平板电泳示意图高效的分辨率浓缩效应电荷效应分子筛效应PAGE的三种分离效应1.加入Seperatinggel约2／32.立即加入蒸餾水2ml以壓平膠體

蒸餾水Separatinggel分离胶的制备SeparatinggelStackinggelcomb1.加入stackinggel2.插入comb注意：浓缩胶要加满插入comb時要注意避免有气泡浓缩胶的制备SeparatinggelStackinggel–＋垂直電泳Bufferdye加样（2）等电点聚焦蛋白质是两性电解质当pH=pI时净电荷为零，在电场中既不向正极也不向负极移动，此时的pH就是该蛋白质的等电点(pI)以PAG为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体，在电场作用下，两性电解质载体在凝胶中移动，形成pH梯度，蛋白质在凝胶中迁移至其pI的pH处，即不再泳动而聚焦成带，这种方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(isoelectricfocusing，IEF)原理:■

等电聚焦的运作机制：-+pH357911++++++-------+--+++---++++--+++----+AdaptedfromAlbertsetal(2002)MolecularBiologyoftheCell(4e)p.487++--（3）双向凝胶电泳2.离子交换层析法

不同载体：离子交换纤维素离子交换交联葡聚糖：兼有分子筛效应离子交换交联琼脂糖++++++-------anionexchangebeadEquilibrationSampleapplicationandwash-----------++++++----E