菌种测定方法

（规范性附录）

枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌的计数和杂菌率的测定A.1原理每个活菌在适宜的培养基和良好的生长条件下，经过合适的培养时间可繁殖成一个肉眼可见的菌落，通过对菌落数量的统计，便可计算出相应样品的单位活菌数。A.2培养基除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T6682规定的三级水或相当纯度的水。按本标准规定的方法配制培养基或购买商品化的产品。A.2.1枯草芽孢杆菌培养基A.2.1.1成分营养琼脂33g；蒸馏水lOOOmL。A.2.1.2制法将33g营养琼脂溶解于蒸馏水中，定容至1000mL；121°C灭菌20min。A.2.2酿酒酵母菌培养基A.2.2.1成分孟加拉红培养基36.6g；蒸馏水lOOOmL。A.2.2.2制法将36.6g孟加拉红培养基溶解于蒸馏水中，定容至lOOOmL；121C灭菌20min。A.2.3.1成分蛋白胨10g；牛肉膏10g；酵母提取物5g；磷酸氢二钾2g；柠檬酸三铵2g；乙酸钠5g；葡萄糖20g；吐温-80ImL；七水硫酸镁0.58g；四水硫酸锰0.25g；琼脂粉20g；灭菌碳酸钙3g；蒸馏水1000mL。A.2.3.2制法将上述试剂依次溶解于蒸馏水中，七水硫酸镁和四水硫酸锰单独用蒸馏水溶解后混入前述溶液中最后加入琼脂粉，定容至1000mL；121°C灭菌20min。A.2.4麦康凯培养基A.2.4.1成分蛋白胨17g；脙胨3g；猪胆盐（或牛、羊胆盐）5g；氯化钠5g；琼脂17g；蒸馏水1000mL；%结晶紫水溶液10mL；%中性红水溶液5mLoA.2.4.2制法将蛋白胨、脙胨、胆盐和氯化钠溶解于400mL蒸馏水中，校正。将琼脂加入500mL蒸馏水中，加热溶解。将两液合并，分装于烧瓶内，121C高压灭菌15min备用。临用时加热溶化琼脂，趁热加入乳糖，冷至50〜55C时，加入结晶紫和中性红水溶液，摇匀后倾注平板。（注：结晶紫及中性红水溶液配好后须经高压灭菌）A.3仪器与设备A.3.1超净工作台。A.3.2天平：感量：0.01goA.3.3震荡器。A.3.4高压灭菌器：2121C。A.3.5生化培养箱：土1C。A.3.6玻璃培养皿。A.3.7移液器：精度为luLoA.3.8显微镜：1000倍。A.3.9玻璃或塑料涂布棒。A.4样品制备按GB/T的规定，采取有代表性的样品200g,按GB/T20195制备试样，装入样品瓶中做好标记后备用。A.5测定步骤A.5.1样品稀释准确称取待测样品10g,放入装有90mL无菌水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中，在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min,即成10t稀释液；再用ImL无菌吸管，吸取10t稀释液ImL移入装有9mL无菌水的试管中，充分混匀即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2菌液ImL移入装有9mL无菌水试管中，即成10-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等一系列稀释度菌液，供平板接种用。A.5.2涂布枯草芽抱杆菌用涂布法：每个样品根据菌量不同取两个相邻合适稀释梯度，用1mL无菌吸管分别吸取不同稀释度菌悬液，加至直径为9cm的培养基平皿的琼脂培养基表面，用无菌玻璃涂布棒将菌悬液均匀涂于琼脂表面。每个稀释梯度做三个平行，同时用无菌水作为空白对照。酿酒酵母菌用混匀法：每个样品根据菌量不同取两个相邻合适稀释梯度，用1mL无菌吸管分别吸取不同稀释度菌悬液1mL,加至直径为9cm平皿中，当培养基冷却至45°C左右（实验中用手触摸温热即可），在每个培养皿中各倒入约15mL培养基，然后迅速旋动培养皿，使菌悬液与培养基充分混匀，置水平位置静止后使之凝固。每个梯度做三个平行，同时用无菌水作为空白对照。植物乳杆菌用混匀法：每个样品根据菌量不同取两个相邻合适稀释梯度，用1mL无菌吸管分别吸取不同稀释度菌悬液1mL,加至直径为9cm平皿中，当培养基冷却至45C左右（实验中用手触摸温热即可），在每个培养皿中各倒入约15mL培养基，然后迅速旋动培养皿，使菌悬液与培养基充分混匀，置水平位置静止后使之凝固。每个梯度做三个平行，同时用无菌水作为空白对照。枯草芽抱杆菌培养基平皿置培养箱内37°C倒置培养17-22h；酿酒酵母菌培养基平皿冷凝后置培养箱内28C倒置培养48h；植物乳杆菌培养基平皿冷凝后37C培养箱倒置培养48h,分别观察菌落形态，鉴别后计数。A.5.4菌落特征A.5.4.1枯草芽抱杆菌：培养基平皿置培养箱内37C倒置培养24h后，菌落不规则，粗糙，不透明，不闪光，蔓延，污白色。A.5.4.2酿酒酵母菌：培养基平皿置培养箱内28C倒置培养48h后，菌落散布在培养基内部，特征为中间粉红色边缘半透明的凸起实心菌落，边缘较整齐。A.5.4.3粪肠球菌：平板培养48h的菌落形态，表面菌落约3毫米宽，凸起，圆，光滑，细密，白色，偶尔浅黄或深黄色；培养基内部菌落呈乳白色不规则散布，边缘不整齐，稍成半球状凸起的实心菌落。A.5.5菌落计数A.5.5.1结果计算枯草芽抱杆菌计数：每克样品的活菌数(CFU/g)=菌落平均数X稀释倍数X10o酿酒酵母菌计数：每克样品的活菌数(CFU/g)=菌落平均数X稀释倍数。粪肠球菌计数：每克样品的活菌数(CFU/g)=菌落平均数X稀释倍数。A.5.5.2菌落计数办法只计算枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌和粪肠球菌(特征)的菌落。当只有一个稀释度，其菌落数在30〜300之间时，则以该菌落数乘以稀释倍数。若有两个稀释度，其菌落数均在30〜300之间，应按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2,计算两者的平均数乘以稀释倍数；若大于2则计数其中较小的菌落数乘以稀释倍数。结果表示：每克样品中的枯草芽抱杆菌、酿酒酵母菌和粪肠球菌菌数，单位为CFU/g，保留三位有效数字。A.6.1杂菌培养和计数取10-i、10-2、10-3三个稀释度的样品液ImL于麦康凯培养基上，充分涂布，待液体完全吸收后倒置于37°C培养箱中培养24-48小时，计数，参照A.5.5计算杂菌数。A.6.2结果计算杂菌率（％）=（杂菌数/酿酒酵母菌活菌数）X100附录B（规范性附录）嗜酸乳杆菌的计数和杂菌率的测定B.1原理每个活菌在适宜的培养基和良好的生长条件下，经过合适的培养时间可繁殖成一个肉眼可见的菌落，通过对菌落数量的统计，便可计算出相应样品的单位活菌数。B.2培养基和稀释液除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T6682规定的三级水或相当纯度的水。按本标准规定的方法配制培养基或购买商品化的产品。B.2.1嗜酸乳杆菌培养基B.2.1.1成分蛋白胨10g；牛肉膏10g；酵母提取物5g；磷酸氢二钾2g；柠檬酸三铵2g；乙酸钠5g；葡萄糖20g；吐温-801mL；七水硫酸镁0.58g；四水硫酸锰0.25g；琼脂粉20g；碳酸钙3g；蒸馏水1000mL。将上述试剂依次溶解于蒸馏水中，七水硫酸镁和四水硫酸锰单独用蒸馏水溶解后混入前述溶液中最后加入琼脂粉，定容至lOOOmL；121°C灭菌20min。B.3仪器与设备B.3.1超净工作台。B.3.2天平：感量：O.Olg。B.3.3震荡器。B.3.4高压灭菌器：2121C。B.3.5生化培养箱：土1C。B.3.6玻璃培养皿。B.3.7移液器：精度为1UL。B.3.8显微镜：1000倍。B.3.9玻璃或塑料涂布棒。B.4样品制备按GB/T的规定，采取有代表性的样品200g,按GB/T20195制备试样，装入样品瓶中做好标记后备用。B.5测定步骤B.5.1样品稀释准确称取待测样品10g,放入装有90mL无菌水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中，在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，即成10t稀释液；再用ImL无菌吸管，吸取10t稀释液ImL移入装有9mL无菌水的试管中，充分混匀即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2菌液ImL移入装有9mL无菌水试管中，即成10-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8等一系列稀释度菌液，供平板接种用。每个样品根据菌量不同取两个相邻合适稀释梯度，用ImL无菌吸管分别吸取不同稀释度菌悬液ImL,加至直径为9cm平皿中，当培养基冷却至45°C左右（实验中用手触摸温热即可），在每个培养皿中各倒入约15mL培养基，然后迅速旋动培养皿，使菌悬液与培养基充分混匀，置水平位置静止后使之凝固。每个梯度做三个平行，同时用无菌水作为空白对照。B.5.3培养嗜酸乳杆菌培养基平皿冷凝后37C培养箱倒置培养48h，分别观察菌落形态后计数。B.5.4菌落特征平板培养48h的菌落形态，表面菌落约3毫米宽，凸起，圆，光滑，细密，白色，偶尔浅黄或深黄色;培养基内部菌落呈乳白色不规则散布，边缘不整齐，稍成半球状凸起的实心菌落。B.5.5菌落计数B.5.5.1结果计算嗜酸乳杆菌计数：每克样品的活菌数（CFU/g）=菌落平均数X稀释倍数。B.5.5.2菌落计数办法只计算嗜酸乳杆菌（特征）的菌落。当只有一个稀释度，其菌落数在30〜300之间时，则以该菌落数乘以稀释倍数。若有两个稀释度，其菌落数均在30〜300之间，应按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2,计算两者的平均数乘以稀释倍数;若大于2则计数其中较小的菌落数乘以稀释倍数。结果表示：每克样品中的嗜酸乳杆菌菌数，单位为CFU/g,保留三位有效数字。B.6杂菌率B.6.1杂菌计数目标菌以外的菌均视为杂菌，对嗜酸乳杆菌进行计数的同时对杂菌进行计数。杂菌率（%）=（杂菌数/嗜酸乳杆菌活菌数）X100芽孢杆菌检测流程（丁酸梭菌）1、此检测方法用来计算每克芽孢杆菌粉剂的活芽孢数量。2、仪器、设备分析天平（O.OOOlg）、超净工作台、涡旋振荡器、恒温振荡器、恒温培养箱、三角瓶、玻璃珠、试管、量筒，1000UL移液枪、lOO^L移液枪，涂布棒，培养皿。3、 无菌器材、溶液无菌蒸馏水、灭菌后的GAM琼脂培养基、已灭过菌的移液管、涂布棒、试管、培养皿等。4、 测定步骤•样品预处理：准确称取1・0OOOg固体样品于已灭菌并烘干的玻璃珠三角瓶中，加入100ml蒸馏水，于摇床上20°C以下摇匀30min。•样品的稀释：1） 取6只无菌试管分别加入9ml无菌水，试管上标记样品号和稀释倍数。操作在超净台中进行。2） 吸取1ml已处理好的试样溶液于第一支试管中，于涡旋振荡器上混匀1min左右，再从第一支试管中吸取lml试样溶液于第二支试管中，依次进行到第6只试管，混匀备用。•稀释样品的平板培养准确移取lml第6只试管试样到已灭菌的空平板中（共6个平板）各个平板均标记菌批号、日期、稀释度。向已加入试样液的空平板中倾入30ml左右的GAM固体培养基，轻轻旋转使之混匀。混匀完成后，倒置放于厌氧培养罐内，并放入三菱牌厌氧产气袋一袋，拧紧罐口，放在37°C恒