M1型巨噬细胞对小鼠膀胱癌MB49细胞活力、迁移、侵袭及凋亡的影响

M1型巨噬细胞对小鼠膀胱癌MB49细胞活力、迁移、侵袭及凋亡的影响*

张暑军，李青青，乔春林，勾璇，王新敏，章乐△（1石河子大学医学院病理生理学教研室/新疆地方病与民族高发病教育部重点实验室，新疆石河子832000；2石河子大学医学院第一附属医院泌尿外科，新疆石河子832008）膀胱癌是常见的恶性肿瘤，在泌尿生殖道肿瘤中膀胱癌发病率位居第一位［1］。研究表明，肿瘤微环境（tumormicroenvironment，TME）与膀胱癌的发生、发展关系密切，而肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤微环境中的主要组成部分，在膀胱癌浸润免疫细胞中的比例可高达50%［2-3］。肿瘤相关巨噬细胞活化类型分为两种表型：M1型和M2型［4］。M1型巨噬细胞可被干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）或脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）激活，并分泌大量促炎细胞因子如白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）等，表达高水平的CD86和诱导型一氧化氮合酶（induciblenitricoxidesynthase，iNOS），主要诱导Th1型免疫应答，被称为肿瘤杀伤性巨噬细胞，一直被认为具有抑瘤效应［5-6］。但研究显示，M1型巨噬细胞也存在促瘤作用，可参与肿瘤的恶性进展。在乳腺癌中，M1型巨噬细胞能诱导乳腺癌细胞T47-D和MCF-7的上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT），并增强诱导细胞的迁移和侵袭能力［7］；在脑胶质瘤中，M1型巨噬细胞可促进脑胶质瘤U251细胞的侵袭［8］。目前M1型巨噬细胞在膀胱癌发生发展中的作用仍不清楚。本项工作以小鼠膀胱癌细胞株MB49为研究模型，并转化小鼠RAW264.7巨噬细胞为M1型巨噬细胞，将其与MB49细胞通过Transwell小室进行体外双层共培养，观察M1型巨噬细胞对MB49细胞活力、迁移、侵袭及凋亡的影响。材料和方法1材料小鼠RAW264.7巨噬细胞系购自中国科学院细胞库；小鼠膀胱癌MB49细胞购自中国上海赛百慷生物有限公司。胎牛血清购自BioloicalIndustries；DMEM、青-链霉素和PBS购自Gibco；LPS购自Sigma；CCK-8购自日本同仁公司；抗小鼠CD86抗体购自Invitrogen；兔抗iNOS抗体购自Abcam；兔抗CD86抗体购自Bioss；小鼠CD86-PE流式抗体购自Invitrogen；Hoechst33258、裂解液PMSF和RIPA、Westernblot制胶液均购自北京索莱宝科技有限公司；0.4μm和0.8μm的Transwell小室购自Corning。2方法2.1RAW264.7细胞和MB49细胞的培养配制完全培养液（含1×105U/L青霉素、100mg/L链霉素和10%胎牛血清的DMEM高糖培养液），将细胞置于5%CO2、37℃恒温培养箱中。观察细胞状态并换液，当培养瓶细胞生长至80%～90%时予以传代。传代培养3次后取对数生长期的细胞用于实验。2.2LPS诱导RAW264.7细胞向M1型极化将处于对数生长期的RAW264.7细胞按3×108L−1接种于6孔板中，培养液每孔2mL，铺板后细胞培养12h，以此时记为0h，然后加入不同浓度的LPS刺激，分别为0、50、100和200μg/L4个组，每组3个复孔，培养细胞24h［9-10］。2.3免疫荧光细胞化学染色法检测RAW264.7巨噬细胞iNOS和CD86表达情况取出LPS刺激24h后的细胞，4%多聚甲醛固定细胞15min，TritonX-100破细胞膜3min，加入牛血清白蛋白于37℃恒温封闭30min，分别加入兔抗iNOS抗体（1∶100）和小鼠抗CD86抗体（1∶100），置于湿盒内37℃恒温孵育3.5h，在暗室中滴加FITC标记的山羊抗兔Ⅱ抗（1∶50）和FITC标记的山羊抗鼠Ⅱ抗（1∶50），避光，置于37℃环境中孵育2h，PI（1∶1000）染核10min，甘油封片［9］。采集细胞图像，再进行半定量分析。2.4Westernblot分析RAW264.7巨噬细胞iNOS和CD86蛋白表达情况取出细胞，加入配好的裂解液（PMSF∶RIPA为1∶100），每孔100～200μL，将6孔板置于冰盒上裂解20～30min。干净的细胞刮刮落贴壁细胞，将液体吸至1.5mL的EP管中，提前预冷离心机至4℃，13684×g离心15min，测定蛋白浓度，配平，加入loadingbuffer，煮蛋白100℃，10min，冷却后蛋白于−80℃冰箱保存。制胶（5%浓缩胶和10%分离胶）；电泳，电压为80V，2h；湿转，电压为80V，1.5h。于摇床上室温封闭2～3h，用含50g/L牛血清白蛋白的TBST配制Ⅰ抗（兔抗鼠CD86单克隆抗体按1∶1000稀释，兔抗鼠iNOS单克隆抗体按1∶500稀释，鼠抗β-actin单克隆抗体按1∶10000稀释）；Ⅱ抗为HRP标记的羊抗兔IgG（1∶10000）或羊抗鼠IgG（1∶20000）；化学发光试剂盒（A液∶B液=1∶1）显影，并于暗室压片［11］。扫描条带灰度值。图像采集后使用ImageJ软件进行分析，分别计算CD86和iNOS与β-actin的比值。2.5流式细胞术检测RAW264.7巨噬细胞表面CD86的表达情况胰酶消化收集巨噬细胞，用1×PBS洗2次，细胞表面CD86的表达情况用直接免疫荧光法进行检测。每100μL的1×PBS加入抗体（PE标记的CD86抗体）1μL，用配好的抗体稀释液重悬细胞，避光，置于37℃环境中，染色30min。1×PBS洗2次，加入300～500μL的1×PBS重悬细胞，上机检测［11］。实验结果为膜分子表达阳性细胞百分率。2.6构建巨噬细胞与膀胱癌细胞的共培养体系实验分为3组：MB49组、MB49与M0巨噬细胞共培养组（M0+MB49组）及MB49与M1巨噬细胞共培养组（M1+MB49组），于6孔板上放置膜孔径为0.4μm的Transwell培养小室，将MB49细胞和不同亚型的RAW264.7巨噬细胞制备成均匀的细胞悬液，上层按实验分组分别加入M0和M1亚型巨噬细胞，下层加入膀胱癌细胞MB49，构建共培养体系，2种细胞均匀分布于各层，共培养。2.7CCK-8实验检测各组MB49细胞的活力将不同分组的MB49细胞制备成均匀的细胞悬液，每组进行细胞计数，把细胞密度调整为4×107L−1，每个试验组设3个复孔；保证每孔细胞密度基本相同，按上述实验分组将单细胞悬液以每孔4×103接种于96孔板，在37℃、5%CO2细胞培养箱中继续培养；在24h后将96孔板终止培养。每孔加入CCK-8溶液10μL，轻轻混匀，把培养板放在37℃、5%CO2细胞培养箱中2h；利用酶标仪测定450nm的吸光度（A）值；计算细胞相对活力，并行统计分析。2.8划痕实验检测各组MB49细胞水平方向的迁移能力待实验组中MB49细胞长至90%左右时，用10μL吸头垂直6孔板笔直划出两条水平的划痕，弃去培养液，用PBS清洗3次，洗去划掉的细胞，然后加入无血清的DMEM培养液，显微镜拍照，此时记为0h，继续于培养箱培养24h，再次于显微镜下拍照，用ImageJ软件计算各组MB49细胞迁移的面积。2.9Transwell实验检测各组MB49细胞的侵袭及垂直方向的迁移能力取出细胞，胰酶消化MB49收集细胞，用不含血清的培养液重悬细胞，向Transwell小室中放入无血清培养液重悬的细胞，保证各组细胞数量一致。Transwell侵袭实验需提前在小室中铺上一层基质胶；于24孔板下室中加入500μL含20%血清的完全培养液，将小室放入24孔板中，培养箱中培养24h；取出Transwell小室，PBS洗两次，4%多聚甲醛固定30min；0.1%结晶紫染色20min，PBS洗3次，棉签擦去小室里未迁移的细胞；风干小室，再于倒置荧光显微镜下拍照［12］；用直接计数法或ImageJ软件计算出各组MB49细胞穿过的数量。2.10Hoechst33258染色检测各组MB49细胞的凋亡情况取出细胞，弃上清液，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定10～15min；PBS洗3次，加入稀释好的Hoechst33258染色液500μL，室温避光孵育20～30min；PBS洗3次，于荧光倒置显微镜下观察并拍照［13］，用ImageJ软件计算出各组MB49细胞凋亡的数量。当细胞发生凋亡时，Hoechst33258染料穿透细胞膜与双链DNA结合，产生比荧光染料自身更强的荧光。因此，凋亡细胞的荧光强度高于正常细胞。若镜下观察细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，即荧光显微镜下观察到亮蓝光，说明细胞发生凋亡。2.11ELISA检测各组炎症因子IL-6的水平收集各组共培养后的细胞培养液上清于EP管中，1100×g离心5min，每组取100μL细胞培养液加入至已被抗体包被的96孔酶标板中，按照ELISA试剂盒说明书对IL-6的含量进行检测。3统计学处理SPSS23.0软件对数据进行统计学分析。实验数据均为至少3次独立重复实验结果，并以均数±标准差（mean±SD）表示。采用方差分析（或t检验）进行组间差异比较，并进一步采用LSD进行组间两两比较。GraphPadPrism5.0软件作图。P结果1Westernblot检测LPS刺激后RAW264.7巨噬细胞中CD86和iNOS蛋白表达水平Westernblot结果显示，0、50、100和200μg/L的LPS刺激巨噬细胞24h后，与对照组（即0μg/L组）相比，RAW264.7巨噬细胞的CD86和iNOS蛋白表达均不同程度地升高，各组CD86蛋白的相对表达量分别为1.00±0.00、1.11±0.10、1.31±0.16和1.12±0.09），各组iNOS蛋白的相对表达量分别为1.00±0.00、3.45±1.24、5.24±0.60和1.51±0.68；当LPS浓度为100μg/L时，CD86及iNOS蛋白的表达水平最高，与对照组相比，差异均有统计学意义（P<0.05），见图1、2。2免疫荧光检测LPS刺激后RAW264.7巨噬细胞中iNOS和CD86蛋白表达及分布Figure1.TheexpressionofCD86proteininmacrophagesdetectedbyWesternblot.Mean±SD.n=3.*PFigure2.TheexpressionofiNOSproteininmacrophagesdetectedbyWesternblot.Mean±SD.n=3.*P免疫荧光结果显示，0、50、100和200μg/L的LPS刺激巨噬细胞24h后，与对照组（即0μg/L组）相比，巨噬细胞上的CD86和iNOS蛋白表达均不同程度地升高，激光共聚焦显微镜下观察到绿色荧光亮度增强，各组CD86蛋白的相对表达量分别为0.03±0.00、0.05±0.00、0.06±0.00和0.05±0.01，各组iNOS蛋白的相对表达量分别为0.05±0.01、0.06±0.00、0.08±0.00和0.07±0.01；当LPS浓度为100μg/L时，CD86及iNOS蛋白表达最高，激光共聚焦显微镜下观察到绿色荧光亮度最亮，与对照组及50μg/LLPS组相比，差异均具有统计学意义（P<0.05），见图3、4。3流式细胞术检测100μg/LLPS刺激RAW264.7巨噬细胞后M1型巨噬细胞所占比例免疫荧光及Westernblot结果显示100μg/LLPS组M1型标志物CD86和iNOS蛋白表达最高，进一步通过流式细胞术检测100μg/LLPS组M1型巨噬细胞所占比例，结果显示，100μg/LLPS组CD86阳性细胞百分率为（95.60±3.21）%，显著高于对照组［（39.17±2.62）%，P<0.01］，见图5。4M1巨噬细胞抑制MB49细胞的活力M0、M1巨噬细胞与小鼠膀胱癌细胞MB49共培养后，CCK-8实验检测各组MB49细胞活力。结果显示，与单独的MB49组（1.00±0.00）相比，MB49+M0组细胞活力（0.96±0.01）显著下降（P<0.01），见图6。5M1型巨噬细胞抑制MB49细胞的迁移能力M0、M1巨噬细胞与小鼠膀胱癌细胞MB49共培养后，细胞划痕测各组MB49细胞迁移能力。结果显示，MB49组细胞的迁移面积为（30.83±1.90）%，MB49+M0组细胞的迁移面积为（21.85±0.56）%；与MB49组及MB49+M0组相比，MB49+M1组MB49细胞的迁移面积为（10.00±0.84）%，迁移能力受到显著抑制（P<0.01），见图7。Figure3.ImmunofluorescencedetectionofCD86expressiononthesurfaceofmacrophages.Thescalebar=50μm.Mean±SD.n=4.*PFigure4.ImmunofluorescencedetectionofiNOSexpressiononthesurfaceofmacrophages.Thescalebar=50μm.Mean±SD.n=5.*P6M1型巨噬细胞抑制MB49细胞的迁移和侵袭能力Figure5.FlowcytometricdetectionofCD86expressioninmacrophages.Mean±SD.n=4.**PFigure6.TheviabilityofMB49cellsineachgroupdetectedbyCCK-8assay.Mean±SD.n=4.**PM0、M1巨噬细胞与小鼠膀胱癌细胞MB49共培养后，Transwell实验检测各组MB49细胞迁移和侵袭能力。（1）迁移能力：MB49+M1组迁移至Transwell小室滤膜下表面的细胞数为63.8±5.7，显著（P7M1型巨噬细胞促进MB49细胞的凋亡M0、M1巨噬细胞与小鼠膀胱癌细胞MB49共培养后，Hoechst33258染色检测各组MB49细胞凋亡情况。结果显示，MB49组凋亡细胞百分率为（11.80±0.84）%；与MB49组相比，MB49+M0组凋亡细胞百分率为（16.04±1.97）%，细胞凋亡数量显著增多（P<0.01），见图9。8ELISA检测各组炎症因子IL-6水平ELISA检测各组炎症因子IL-6的分泌水平，结果显示，MB49+M1组细胞培养上清液中IL-6的浓度为（72.11±3.66）ng/L，显著（P讨论肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤微环境的关键细胞，在肿瘤存活和进展中起着关键性作用，能响应于各种微环境信号从而改变它的功能表型，主要分为M1型和M2型巨噬细胞［14-15］。根据以往的研究，M1型巨噬细胞一直被认为对肿瘤的生长起抑制作用，而M2型巨噬细胞促进肿瘤的生长［2，15］。Jiang等［16］的研究表明，M1型巨噬细胞抑制食管鳞状细胞癌细胞的迁移和侵袭。在肺癌中，M1型巨噬细胞抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡，发挥抗肿瘤作用［17］。但近年来有研究表明，M1型巨噬细胞存在促瘤的作用，Jin等［8］观察到M1型巨噬细胞可促进脑胶质瘤U251细胞的侵袭；Bednarczyk等［7］检测到M1型巨噬细胞能诱导乳腺癌细胞T47-D和MCF-7发生EMT，并增强细胞的迁移和侵袭能力，靶向M1巨噬细胞可能会抑制EMT并限制乳腺癌的侵袭潜力。目前M1型巨噬细胞对肿瘤是促进还是抑制作用仍然存在争议，M1型巨噬细胞在膀胱癌发生和进展中的作用仍不明确，有待进行更多的基础研究。因此，本研究旨在体外明确M1型巨噬细胞对小鼠膀胱癌细胞株的影响。Figure7.ThemigrationofMB49cellsineachgroupdetectedbyscratchassay.Thescalebar=50μm.Mean±SD.n=6.**P肿瘤微环境中巨噬细胞的极化与膀胱癌的发生发展相关［18-20］。Takeuchi等［19］表明，高密度M2型巨噬细胞在膀胱癌中可影响微血管、病理结果、肿瘤分级和侵袭性，是预后较差的因素。有体外实验和裸鼠移植瘤模型实验均证实，M2型巨噬细胞会抑制膀胱癌细胞凋亡，从而促进膀胱癌的增殖和侵袭［20］。而M1型巨噬细胞与膀胱癌细胞的关系研究甚少。有研究观察到，在外界刺激下，巨噬细胞会发生极化，表型、形态及功能方面的改变，通常会以旁分泌的方式分泌一些物质来调节肿瘤细胞的存活和侵袭［18］。为了观察微环境中M1型极化的巨噬细胞对膀胱癌的影响，本实验选用小鼠RAW264.7巨噬细胞和小鼠膀胱癌细胞株MB49为研究模型。在体外先将RAW264.7巨噬细胞诱导为M1亚型，通过对M1型巨噬细胞表型标志物CD86和iNOS进行检测［21-22］，构建了成功的M1型巨噬细胞极化模型且极化比例可达90%以上，为后续研究M1型巨噬细胞和小鼠膀胱癌细胞株MB49的关系奠定了实验基础。本研究随后将M1型巨噬细胞与小鼠膀胱癌细胞株MB49通过Transwell小室在体外进行双层共培养，观察癌细胞MB49活力、迁移能力和侵袭能力的变化及细胞凋亡的情况，结果显示M1型巨噬细胞与小鼠膀胱癌细胞株MB49共培养后，膀胱癌细胞活力降低，迁移和侵袭能力减弱，细胞凋亡增多，说明M1型巨噬细胞能抑制小鼠膀胱癌细胞的生长。在以往对膀胱癌的研究中，Dufresne等［23］观察到与M1型巨噬细胞共培养的膀胱癌细胞株T24其活细胞数量较低，同时M1巨噬细胞衍生因子抑制T24细胞生长；在裸鼠膀胱癌皮下移植瘤模型中，PD-1抑制剂nivdumab可使肿瘤组织中M2型巨噬细胞向M1型极化，抑制皮下移植瘤的生长速度［20］，这与我们的研究结果相一致，证明了M1巨噬细胞在膀胱癌中起抑癌作用。为了进一步探究微环境中分泌因子与膀胱癌细胞之间的关系，本实验观察了各组中炎症因子IL-6的浓度，结果显示MB49+M1组的IL