《细胞生物学》教案-细胞6章蛋白质分选与膜泡运输10

PAGE1《细胞生物学》教案 （第10次课2学时）第六章蛋白质分选与膜泡运输（ProteinSortingandMembranetrafficking）[教学要求]2.1知识目标1.熟练掌握核糖体与蛋白质合成,信号假说；2.掌握三种包被膜泡的结构与功能；3.供体膜与靶膜融合的机制。2.2能力目标1.讲解三位诺贝尔获奖科学家的研究成果；2.讲解共翻译转运和后翻译转运的过程；2.3德育目标1.在分析细胞运输途径时，阐述细胞内膜系统对于扩大细胞膜表面积的重要意义，并引入扩大内需是确保我国经济稳定健康发展的根本之策这一思政内涵；2.引导学生学习科学家的科研思维、科研精神。[教学重点]内质网、高尔基体的结构特点溶酶体的发生及功能[教学难点]内膜系统各结构之间的关系[教学时数]2学时[主要内容]6.1细胞内蛋白质的分选6.2细胞内膜泡运输[参考资料]翟中和．细胞生物学，第五版．北京：高等教育出版社，2020．[教学内容]2013年10月7日，诺贝尔生理学或医学奖揭晓，该奖授予了发现了细胞囊泡运输调控机制的三位科学家，分别是美国耶鲁大学细胞生物学系主任詹姆斯•罗斯曼(JamesE.Rothman)、美国加州大学伯克利分校分子与细胞生物学系教授兰迪•谢克曼(RandyW.Schekman)以及美国斯坦福大学分子与细胞生理学教授托马斯•聚德霍夫(ThomasC.Südhof)。包被囊泡转运囊泡储存囊泡分泌囊泡无包被囊泡（囊泡膜上的膜蛋白和脂类等，参与细胞的组成与特定的细胞功能）（囊泡所包裹的内含物，如神经递质、激素、各种酶和细胞因子等，可参与蛋白质或脂类的降解或剪切功能等，或者分泌到细胞外，调节自身或其他细胞的功能）动力（动力蛋白质）车辆（运输复合体）货物（囊泡上的分子）行驶路线（微管）交通控制（调节分子）细胞内的囊泡运输系统，就好比一个城市的交通运输系统，各种具有动力(即动力蛋白)的不同车辆(即运输复合体)装载着所运输的不同货物(即囊泡上的货物分子)，按照指定的行驶路线(即微管)抵达目的地后，完成货物的卸载。一个城市的良好交通运输状况，需要精细的交通控制(即调节分子)。如果控制得不好，某些地方就会出现交通拥堵，严重时整个城市的交通都会瘫痪。当类似情况出现在我们的细胞内时，这些细胞就无法实现正常功能，甚至会因而死亡。2013诺贝尔生理学和医学奖简单图解生物膜构成了细胞及细胞器之间的天然屏障，使得一些重要的生命活动能在相对独立的空间内进行，由此产生了细胞之间、细胞器之间的物质、能量和信息交换的过程。细胞内的膜性细胞器之间的物质运输(如蛋白质、脂类)，主要是通过囊泡完成的。囊泡是由单层膜所包裹的膜性结构，从几十纳米到数百纳米不等，主要司职细胞内不同膜性细胞器之间的物质运输，称之为囊泡运输。细胞内的囊泡有很多种，按结构特征，可以分为包被囊泡和无包被囊泡两类；按生理功能，可分为转运囊泡、储存囊泡、分泌囊泡等。通过囊泡运输的物质主要有两类，一类是囊泡膜上的膜蛋白和脂类等，参与细胞器的组成与特定的细胞功能(如细胞代谢和信号转导等)；另一类是囊泡所包裹的内含物，如神经递质、激素、各种酶和细胞因子等，这些物质可参与蛋白质或脂类的降解或剪切功能等，或者分泌到细胞外，调节自身或其它细胞的功能。早在上世纪的1970年代，兰迪•谢克曼（RandySchekman）便被细胞如何调节其内部输运机制深深吸引并投身此项研究，并试图利用酵母菌作为模型样本来研究其背后的基因机制。在基因筛选中，他找到一些显示出输运机制缺陷的酵母菌细胞，其表现就像是一个缺乏指挥协调而一片混乱的公共交通系统，其内部囊泡堆积在细胞内的部分区域。他发现造成这种囊泡发生“交通堵塞”的原因是基因层面的，并据此顺藤摸瓜找到了其背后的基因机制。他找到了3组不同的基因对这一细胞运输机制产生作用，从而改变并大大加深了我们对细胞如何规范其内部输运系统的认识。詹姆斯•罗斯曼（JamesRothman）同样对细胞输运机制感到好奇。在上世界80~90年代期间，Rothman正开展对哺乳动物细胞囊泡输运机制的研究，他发现一种蛋白质可以让囊泡实现与其目标细胞膜的对接和融合。在融合过程中，囊泡上的蛋白质和细胞膜上的蛋白质相互托马斯•聚德霍夫（ThomasSüdhof）对大脑内神经细胞是如何相互之间进行沟通感兴趣。这种传递信息的物质被称为神经传递素，这种特殊分子正是由囊泡负责运输至神经细胞的细胞膜上并借助融合机制向外释放的。这正是Rothman和Schekman所发现的机制。然而这些囊泡只有在其所在的神经细胞向其“邻居”发送信号之后才会被允许释放它们运载的“货物”。这种精确的时机把握究竟是如何实现的？科学家们此前便已经知道钙离子参与了这一过程，在上世纪90年代，Südhof便开始在神经细胞中寻找对钙离子敏感的蛋白质。最终他识别出一种分子机制，其会对注入的钙离子做出反应，并控制邻近的蛋白质迅速让囊泡与神经细胞的外部细胞膜相结合。于是“拉链”打开了，信号物质被释放出去。Südhof的发现解释了这种细胞传输的时间精确性是如何实现的，以及囊泡中的物质是如何实现受控地释放。他们的工作揭示了细胞内部和外部的输运体系是如何达成时间与位置上的精确性的。在细胞中，不管是酵母菌还是人类，不管高等生物还是低等生物，它们体内的囊泡输运以及细胞膜融合机制都遵循相同的基本原理。这一体系对于一系列的生理过程而言都至关重要，从大脑信号的传递，到荷尔蒙的释放，再到免疫细胞活素。但当发生疾病时，细胞内的囊泡输运机制会出现问题，这当中包括一些神经系统和免疫系统疾病。离开这一堪称完美的控制机制，细胞将陷于混乱。细胞内蛋白质的分选蛋白质分选（proteinsorting）或蛋白质寻靶（proteintargeting）依靠蛋白质自身信号序列，从蛋白质起始合成部位转运到其功能发挥部位的过程。蛋白质分选不仅保证了蛋白质的正确定位，也保证了蛋白质的生物学活性。（真核细胞中除线粒体和植物细胞叶绿体中能合成少量蛋白质外，绝大多数蛋白质都是由核基因编码，起始合成均发生在游离核糖体上，然后或在细胞质基质（游离核糖体）中完成翻译过程，或在粗面内质网膜结合核糖体上完成合成。然而，蛋白质发挥结构或功能作用的部位几乎遍布细胞的各种区间或组分。因此必然存在不同的机制以确保蛋白质分选，转运至细胞的特定部位，也只有蛋白质各就各位并组装成结构与功能的复合体，才能参与实现细胞的各种生命活动）（合成的位点在核糖体，合成的蛋白起作用的位点在细胞的各个部位；即蛋白质各就各位并组装成结构与功能的复合体，才能参与细胞的各种生命活动，这一过程称蛋白质的定向转运或蛋白质分选）信号假说与蛋白质分选信号20世纪60年代，乔治•帕拉德(GeorgePalade)等发现，细胞分泌的蛋白需要先进入内质网，再到高尔基体，然后分泌到胞外。这个细胞分泌途径的重大发现，使他获得了1974年诺贝尔生理学或医学奖1972年Milstein和他同事用分离纯化的核糖体在无细胞体系中用编码免疫球蛋白轻链的mRNA指导合成多肽，发现合成的多肽比分泌到细胞外的成熟的免疫球蛋白在N端有一段多出的肽链，推测这段肽链具有信号作用。Blobel、Dobberstein和Walter在上述发现的基础上用分离的微粒体和无细胞体系进行了大量的实验，进一步证实了信号序列的存在及其作用。（1971，G.BlobelandD.Sabatini（研究抗体生成时发现的，血液中流动的抗体跟细胞中合成的抗体，在无细胞系统中合成，合成的抗体的长短及分子量都不一样，成熟的抗体发现少了一段，就认为N末端少了的一段有信号的功能；）1975年甘特尔•布洛贝尔(GunterBlobel)提出信号假说，认为蛋白质N端的信号肽，指导蛋白质转至内质网上合成，获1999年诺贝尔生理医学奖。信号假说（signalhypothesis）：①分泌蛋白N端序列作为信号肽，指导分泌性蛋白质在内质网膜上合成②在信号肽引导下蛋白质边合成边通过移位子（translocon）蛋白复合体进入内质网腔，在蛋白质合成结束之前切除信号肽。信号序列在分泌蛋白质转运中的作用Milsteinetal:StudyingthesynthesisoflightchainofIgC(incell-freesystems,20AalongeratN-terminalendthantheauthenticlightchain)(在无细胞系统中，边合成边转运，得到的蛋白质无信号肽；如果在游离核糖体上先不加微粒体不加SRP，则最后带有信号肽；)指导分泌性蛋白在rER上合成的决定因素蛋白质N端的信号肽（signalpeptide）信号识别颗粒（signalrecognitionparticle，SRP）信号识别颗粒的受体（又称停泊蛋白，dockingprotein，DP）信号肽（signalpeptide）：信号肽位于蛋白质的N端，一般由16~26个氨基酸残基组成，其中包括信号肽疏水核心区、N端和C端等3部分；由于信号肽又是引导肽链进入内质网腔的一段序列，又称开始转移序列(starttransfersequence);特点：无特异性作用：通过与SRP的识别和结合，引导核糖体与内质网膜结合；通过信号序列的疏水性，引导新生肽跨膜转运。信号肽的一级结构序列信号识别颗粒（signalrecognitionparticle，SRP）：信号识别颗粒是由6种不同蛋白质和一个7S小RNA分子构成的RNP(核糖核蛋白)颗粒。（SRP含有2种结构域，即信号肽识别结构域和核糖体结合结构域，其中信号肽识别结构域中的p54蛋白是一种包含成簇Met残基的GTP酶，Met侧链与信号肽的疏水核心结合；当SRP与信号肽结合后，核糖体结合结构域中的p9和p14蛋白复合体阻断新生肽链的翻译。SRP通常存在于细胞质基质中，等待信号肽从多核糖体上延伸暴露出来，SRP既可与新生信号肽序列和核糖体大亚基结合，又可与内质网膜上SRP受体结合，指导新生多肽及核糖体和mRNA附着到内质网膜上。细胞质基质中必须有一个识别信号肽的SRP颗粒，一旦与信号结合则蛋白合成叫停；SRP是由6种不同的多肽构成的复合物，另外有300个核苷酸组成的RNA与这个复合物结合，因此SRP是一个核糖核蛋白颗粒；这个结构涉及到至少3部分结构域，一个是与核糖体相互作用的结构域，第二个是要有识别叫停蛋白信号肽的结构域，第三个是与受体蛋白相互作用识别的结构域）信号识别颗粒的受体（又称停泊蛋白，dockingprotein，DP）：DP是内质网膜的整合蛋白，由α和β亚基组成，可特异地与SRP结合。α亚基可结合GTP。信号肽酶（signalpeptidase）：内质网腔面上蛋白水解酶，负责切除并快速降解新生多肽的N端信号肽序列。（在相应内质网膜上有相应SRP的受体（GTPbindingprotein），可以将核糖体带入内质网膜上，构成所谓功能性结合的粗面内质网）共翻译转运（cotranslationaltranslocation）：分泌蛋白向rER腔内的转运是同蛋白质翻译过程偶联进行的，这种蛋白在信号肽引导下边翻译边跨膜转运的过程称为共翻译转运。分泌性蛋白的合成与跨越内质网膜的共翻译转运图解膜蛋白的共翻译转运机理膜蛋白的共翻译转运涉及几个问题：（1）靠疏水区滞留在内质网膜上；（2）单次跨膜和多次跨膜；（3）跨膜段的定向开始转移序列（starttransfersequence）：位于新生肽链N端的信号序列（信号肽）（最终不保留），既可被SRP识别，又可引导新生肽链开始穿膜转移。内部信号锚定序列（internalsignal-anchorsequence,SA）：位于新生肽链内部的疏水序列，既是信号序列，又是肽链跨膜锚定在脂双层中的序列。内部停止转移锚定序列（internalstop-transferanchorsequence,STA）：位于新生肽链内部的疏水序列，既是肽段终止转移，又是肽链跨膜锚定在脂双层中的序列。多次跨膜蛋白：含有多个SA和多个STA的肽链将成为多次跨膜蛋白。跨内质网膜肽段的取向：一般而言，带正电荷氨基酸残基多的一侧，朝向细胞质基质一侧（外侧）。（肽链上的一段与内质特殊AA序列，与内质网膜具有很强的亲合力而结合在脂双层之中，能阻止肽链续进入内质网腔，使其成为跨膜蛋白质）（跨膜的方向性是由信号肽两侧氨基酸所带电荷的性质决定的）内质网膜整合蛋白的拓扑学类型STA：内部停止转移锚定序列SA：内部信号锚定序列（STA:其信号肽在N端，有一个STA，一旦停止转移序列进入移位子，并与其位点相互作用，移位子钝化，停止转移过程。信号肽释放，STA留在膜中称为单次的a螺旋跨膜片段，N端在膜的腔内侧，C端在基质侧。SA：既是开始转移序列，又作为停止转移序列，保留在脂双层中成为单次跨膜的a螺旋；SA前后所带电荷决定其插入的方向。具有较多正电荷氨基酸的一端朝向细胞质基质。(基本规律：新生肽链在膜蛋白通道里面，一般带正电荷的一侧是面向细胞质基质一侧；这个也是跨膜蛋白跨膜的拓扑学特征；）线粒体、叶绿体和过氧化物酶体的蛋白质的信号序列特称为导肽（leaderpeptide），其基本的特征是蛋白质在细胞质基质中的游离核糖体上合成以后再转移到这些细胞器中，因此称这种翻译后再转运的方式为后翻译转运（post-translationaltranslocation）。这种转运方式在蛋白质跨膜过程中不仅需要消耗ATP使多肽去折叠，而且还需要跨膜后由分子伴侣帮助蛋白质再正确折叠形成有功能的蛋白。继信号假说提出与确证后，人们又发现一系列蛋白质分选信号序列，统称信号序列（signalsequence），而且有些信号序列还可形成三维结构的信号斑（signalpatch），指导蛋白的靶向转运和定位。分选信号：一个是向细胞核的输入（赖氨酸），要有核定位信号；二是核输出信号（苯丙氨酸，赖氨酸）；三是线粒体里转运蛋白的输入信号（精氨酸，赖氨酸）；四是向质体里输入的信号（以丝氨酸为主）；五是向过氧化物酶体输入的信号（三肽序列：丝氨酸，赖氨酸，亮氨酸）；六是输入到内质网里的信号（构成信号肽）；六是从内质网滞留的信号（四肽序列）信号肽与信号斑（信号斑存在于完成折叠的蛋白质当中，构成信号斑的信号序列之间可以不相邻）蛋白质分选转运的基本途径与类型途径：共翻译转运后翻译转运类型：跨膜转运膜泡运输选择性门控转运细胞质基质中蛋白质的转运核基因编码的蛋白质的分选大体可分2条途径：（1）共翻译转运（cotranslationaltranslocation）途径：在游离核糖体上起始合成由信号肽和与之结合的SRP引导转移至糙面内质网新生肽边合成边转运→糙面内质网腔或定位在ER膜上→经转运膜泡运到高尔基体加工包装→分选至溶酶体、细胞质膜或分泌到细胞外。（2）后翻译转运（post-translationaltranslocation）途径在细胞质基质游离核糖体上合成以后→细胞核、线粒体、叶绿体和过氧化物酶体，或者成为细胞质基质的可溶性驻留蛋白和骨架蛋白。（共翻译转运（cotranslationaltranslocation）途径：即蛋白质合成在游离核糖体上起始之后，由信号肽和与之结合的SRP引导转移至糙面内质网，然后新生肽边合成边转入糙面内质网腔或定位在ER膜上，经转运膜泡运到高尔基体加工包装再分选至溶酶体、细胞质膜或分泌到细胞外。这种蛋白在信号肽引导下边翻译边跨膜转运的过程称为共翻译转运。注意：内质网和高尔基体本身的蛋白质分选也按此途径来完成。后翻译转运（post-translationaltranslocation）途径：即蛋白质在细胞质基质游离核糖体上合成以后，再转移到膜围绕的细胞器，如细胞核、线粒体、叶绿体和过氧化物酶体，或者成为细胞质基质的可溶性驻留蛋白和骨架蛋白。酵母中有些分泌蛋白由结合ATP的分子Bip蛋白（Bip-ATP）与膜整合蛋白Sec63复合物相互作用，水解ATP提供动力驱动翻译后转运途径，即分泌蛋白在细胞质基质游离核糖体上合成后，再转运至内质网中。）（在真核细胞里，边合成边延伸，边进入内质网腔的转运，叫共翻译转运；共翻译转运涉及到的结构细胞质基质当中一种信号识别蛋白，SRP；在内质网膜上有一个SRP的受体，合成的蛋白上有信号序列，膜上有通道蛋白transpoter(转运子蛋白)；发现这种方式在古细菌和真细菌也如此）（翻译后转运：真核细胞涉及到的结构是一个sec62,63,71,72四种蛋白形成的复合物，帮助合成的蛋白跨膜，进入内质网腔内涉及到一个分子伴侣Bip，帮助蛋白重新折叠;主要在真核细胞里）（还有一种翻译后转运发生在细菌里，是靠ATP酶secA，在膜上通过水解ATP提供能量，帮助蛋白进入细胞外的空间）左：共翻译转运右：后翻译转运（蛋白质合成都是在核糖体上进行，例如共翻译转运和后翻译起始位点都发生在游离核糖体上，然后看其有无信号，如果有分选信号则N末端的内质网定位信号引导核糖体进入粗面内质网膜，如果没有分选信号则在细胞质基质完成蛋白质合成；）根据蛋白质分选的机制或转运方式不同，又可将蛋白质转运分为4类：（1）跨膜转运（transmembranetransport）：进入内质网腔或插入内质网膜、线粒体、叶绿体和过氧化物酶体等（2）膜泡运输（vesiculartransport）：糙面内质网高尔基体→细胞的不同部位。（3）选择性门控转运（gatedtransport）：进入细胞核（核孔复合体）（双向）（4）细胞质基质中蛋白质的转运：与细胞骨架系统密切相关，其它不明。（合成的位点在核糖体，合成的蛋白起作用的位点在细胞的各个部位；即蛋白质各就各位并组装成结构与功能的复合体，才能参与细胞