红芪替换补中黄芪对免疫抑制小鼠免疫功能的影响

红芪替换补中黄芪对免疫抑制小鼠免疫功能的影响

红仁是蔷薇科岩石黄鼠尾科的干燥根。它的皮肤是红棕色的。它与黄鼠尾科的其他物种（radixastagali）一起形成。两者均具有补气固表、益气利尿、托毒排脓、敛疮生肌等功效,临床常将两者等同而视,广泛应用于治疗和养生保健。而1985年版中国药典开始将红芪单列为一种中药品种,对红芪与黄芪的比较研究逐渐增多。发现两者在成分、效用方面有区别,同时有报道发现在免疫调节方面也存在差异,这些发现推动了红芪在临床上的应用。而复方是中医防治疾病的主要临床应用形式,目前尚缺乏对红芪与黄芪在经典方剂中的药效对比研究。为此,本文选择了2010年中华人民共和国药典中以黄芪作为君药,具有免疫调节作用的经典补益方剂——益气养血口服液和补中益气口服液作为研究对象,以相同剂量的红芪替换黄芪,比较其免疫调节作用的异同,为合理开发红芪的药用价值和推广应用提供一定的理论依据。1材料表面1.1医学动物实验中心提供昆明种小鼠60只,雌雄各半,体重18～22g,兰州大学医学动物实验中心提供,合格证号:SCXK(甘)2009-0004。K562细胞株由兰州大学实验中心提供。1.2红治疗小鼠的相关水提物的制备中药材购于兰州市药材市场,经兰州大学基础医学院中西医结合研究所程卫东教授鉴定合格;参照2010年中华人民共和国药典,配制补中益气方剂和益气养血方剂;同时用相同剂量的红芪替换复方中的黄芪配成相应用红芪的补中益气和益气养血方剂。以上各方均按照文献通过体表面积换算为小鼠的剂量。各组相应水提物制备严格按照药典所述方法进行煎制,将药物浓缩为1g/mL,其中补中益气各组水提物剂量为4g/(kg·d),益气养血各组水提物剂量为6g/(kg·d),放置冰箱冷藏备用。环磷酰胺(CY)粉针剂(国药准字H31021703)为上海华联制药公司产品,用生理盐水溶解,配制所需浓度。1.3elisa试验剂EZ-SepTMMOUSE1X淋巴细胞分离液、小鼠白细胞介素-4(IL-4)、γ-干扰素(IFN-γ)ELISA试剂盒(深圳达科为生物技术有限公司);FITC-抗小鼠CD3、PE/Cy5-抗小鼠CD4、PE-抗小鼠CD8、PerCP-抗小鼠CD19单克隆抗体(Biolegend公司);680型酶联仪(美国BIO-RAD公司);超纯水机(艾科浦,型号AF2-0502-U);流式细胞仪(美国贝克曼COULTER公司)。2方法2.1免疫抑制大鼠模型的建立小鼠腹腔注射CY50mg/(kg·d),连续7d,制备免疫抑制小鼠模型。2.2各组大鼠血清中益气养血、用红楸益气养血组1例将60只小鼠随机分为6组:对照组、模型组、补中益气组、用红芪补中益气组、益气养血组、用红芪益气养血组,每组10只。对照组给予0.9%盐水,各中药组分别于给予CY同时按4g或6g(kg·d)给药,灌胃量均为0.02mL/g,1次/d,连续14d。2.3小鼠尾腺指数、脾指数测定末次给药后次日,用电子天平精确称取小鼠体重,眼球取血处死,无菌摘取小鼠胸腺、脾脏称重,分别计算胸腺指数、脾脏指数。计算公式:胸腺指数或脾指数=胸腺或脾脏质量(mg)/体重(g)。2.4分析胰腺中的细胞分离按EZ-SepTMMOUSE1X淋巴细胞分离液说明书操作:在35mm培养皿中加入4mLEZ-SepTMMOUSE1X淋巴细胞分离液,将200目尼龙网铺于培养皿上。取脾脏置于尼龙网上面,研压脾脏,使其成为分散的单个细胞。将含有脾细胞的淋巴细胞分离液立即转移到15mL离心管,再加入200μL1640培养液,形成界面。2000r/min离心30min,吸出淋巴细胞于15mL离心管,再加入10mL1640培养液,混匀,1000r/min离心10min,弃上清,加入1mL1640培养液。细胞计数,调整为所需细胞浓度。2.5细胞调干试验按2.4方法制备细胞浓度为1×1012L-1的脾细胞悬液,分别取细胞悬液100μL,加FITC-抗小鼠CD31μL、Percp-抗小鼠CD191.25μL,或FITC-抗小鼠CD31μL、PE/Cy5-抗小鼠CD41.25μL、PE-抗小鼠CD81.25μL,轻轻旋转混合,4℃冰箱避光孵育30min,PBS洗细胞1次,2300r/min离心5min,弃上清,细胞沉淀内加500μLPBS,混匀,上流式细胞仪检测。2.6血清收集血清各组小鼠眼眶静脉丛采血,自然凝固,放置3h,使血清充分析出,1500r/min离心10min,收集血清。用生理盐水将血清稀释10倍,用ELISA法检测血清IL-4、IFN-γ的含量,操作步骤严格按说明书进行,检测结果经酶标仪450nm波长测定OD值,根据标准品绘制标准曲线,以mg/L为单位,计算其含量。2.7统计学分析采用SPSS17.0软件对数据进行单因素方差分析,组间比较采用LSD-t检验,计量资料采用ˉx±s表示,以P<0.05为有统计学意义。3结果3.1中医药组对免疫抑制大鼠器官指数的影响结果见表1。3.2中医药组对免疫抑制大鼠淋巴结亚组的影响结果见表2。3.3各组对血清il-4和ifn-4含量的影响结果见表3。4不同对红治疗的对免疫调节的作用传统认为红芪与黄芪性味归经和功效相似,而经常等同使用。但两者不仅外观区别明显,在化学成分的含量和类型等方面也明显不同,尤其在皂苷类差异更大。中药复方通过君臣佐使的协调配合,以增强疗效,减少毒副作用,体现了中医辨证论治的特色优势。所以,通过研究用红芪和用黄芪的补益方剂对免疫功能的调节作用,可进而探讨黄芪和红芪免疫调节效应的异同。补中益气和益气养血方剂均为以黄芪为君药的经典补益方剂,具有确定的免疫调节作用。选择这2个方剂为研究对象,观察其用红芪和用黄芪之不同配伍的免疫调节效应,具有较好的代表性。在采用环磷酰胺诱导建立免疫抑制动物模型基础上,分别给予用红芪和用黄芪的经典补益剂进行干预和研究。结果表明,用黄芪和用红芪的补中益气和益气养血水提物均能保护和改善胸腺和脾脏器官,调节环磷酰胺诱导的脾脏中T、B细胞亚群的失衡,恢复T、B淋巴细胞亚群的正常比例,表明在所选的经典补益剂中,以等量红芪替换黄芪作为君药进行对比,显示出相似的免疫调节作用。同时在恢复脾脏免疫状态、提高CD3+T淋巴细胞总数百分比和血清