噬菌体展示技术与外源蛋白质的研究进展

噬菌体展示技术与外源蛋白质的研究进展

近年来，pdt更新技术广泛应用于免疫、多媒体、蛋白质和酶的制备，以及对蛋白质和酶的发现和开发、蛋白质和酶的相互作用、蛋白质结构和功能的解释等方面。它具有简单、有效、易于控制的特点，为蛋白质研究的独特优势和巨大应用潜力提供了辩护。本文概括介绍了不同的噬菌体展示系统及其在蛋白质研究中的应用。1.噬菌体显示技术作为一项已广泛运用的技术,噬菌体展示是一种将外源肽或蛋白质与特定噬菌体衣壳蛋白融合并展示于噬菌体表面的技术。它将外源基因插入到噬菌体展示载体的信号肽基因和衣壳蛋白编码基因之间,从而使外源基因编码的多肽或蛋白质与外壳蛋白以融合蛋白质形式展示在噬菌体表面,被展示的外源肽或蛋白质可保持相对独立的空间结构和生物活性。与其他表达系统相比,噬菌体展示技术可将基因型和表型、分子结合活性与噬菌体的可扩增性结合在一起,实现了基因型和表型的转换,是一种高效的筛选系统。噬菌体显示技术主要包括三方面内容(图1):一是通过DNA重组的方法插入外源基因,形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面,同时保持外源蛋白的天然构象,不影响噬菌体的生活周期,也能被相应的抗体或受体所识别;二是筛选目的噬菌体,利用固定于固相支持物的靶分子,采用适当的淘洗方法,洗去非特异结合的噬菌体,筛选出融合噬菌体;三是外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面,而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过分泌型噬菌体的单链DNA测序推导出来。噬菌体亲和筛选的方法包括直接法和间接法,前者是将蛋白质分子偶联到固相支持物上,加入噬菌体肽库,与固相支持物温育,洗去未结合的噬菌体,既获得亲和噬菌体,其中固相支持物有很多,包括树脂、各种尺寸的珠子、96孔板甚至可用于分析的生物传感芯片;后者是将生物素标记的蛋白质分子与文库噬菌体温育后铺在结合有链亲和素的平皿上,洗去未结合的噬菌体,保留结合状态的噬菌体,再洗脱结合的噬菌体,用这部分噬菌体感染细菌,扩增噬菌体,开始新一轮的筛选,通过吸附、洗脱、扩增的重复过程,就能选择性地富集并特异性扩增结合这种蛋白质或DNA分子的噬菌体。筛选出的噬菌体的结合特性可以通过基因测序,分析各个克隆间编码短肽的一致序列,以确证筛选的特异性。最后,可研究其氨基酸短肽的亲和特性并推测可能配体的生物学活性和结合或游离状态的结构特点。2.噬菌体的选择目前,用于构建噬菌体展示系统的载体主要有丝状噬菌体、λ噬菌体、T4噬菌体和T7噬菌体,且各系统各具优缺点,选用适合的噬菌体展示系统对研究具有重要意义(表1)。2.1iii蛋白的融合丝状噬菌体属于单链环状DNA病毒,编码10种蛋白质,其中与噬菌体展示有关的是pIII和pVIII衣壳蛋白。pIII蛋白位于噬菌体颗粒的一端,有3~5个拷贝,可在N端、近N端或N端与C端的柔性连接区融合外源肽或蛋白质,并且对展示的外源多肽或蛋白质的大小无严格限制。VIII蛋白位于噬菌体颗粒的两侧,一般在N端或近N端融合外源序列,与pVIII基因融合时,每个病毒粒子约有2700个拷贝,含有pVIII的融合蛋白能够提供多价展示,从而根据亲和力进行目的基因的筛选。2.2外源蛋白装复λ噬菌体展示系统是将外源肽或蛋白质与λ噬菌体的主要尾部蛋白(thetailprotein,gpV)或λ噬菌体头部组装的必需蛋白(theheaddecorationprotein,gpD)蛋白融合而被展示的。在λ噬菌体头部组装过程中,当DNA进入头部以后,头部组装蛋白gpD附着于衣壳外侧,将噬菌体头部固定。gpD是λ噬菌体头部组装必需的蛋白质,也称装饰蛋白。当噬菌体基因组小于野生型基因组的82%时,它可以在缺少gpD的情况下完成组装,故gpD可作为外源序列融合的载体,这种展示一般为N端展示。gpD展示的体外组装途径是将D融合蛋白结合到λD-噬菌体表面。体内组装途径是将含D融合基因的质粒转化入λD-溶源的E.coli菌株中,从而弥补溶源菌所缺的gpD,并通过热诱导组装,或利用噬菌体P1的Cre-LoxP定点重组系统将外源基因整合到λ噬菌体基因组中。此外,λ噬菌体的主要尾部蛋白gpV也可以插入外源序列。gpV有两个折叠区,C端的折叠区是病毒的非功能区,可供外源序列插入或替换。该系统展示的外源蛋白质的拷贝数为平均1个分子/噬菌体,这表明外源蛋白质或多肽可能干扰了噬菌体的尾部装配。λ噬菌体是在宿主细胞内完成装配的,无需将外源肽或蛋白分泌到细菌胞膜外,可展示有活性的大分子蛋白质(100kDa以上蛋白质)及对宿主细胞有毒性的蛋白质,适用范围极广。目前,已通过构建λ噬菌体的完整基因组文库发现了新的肺炎支原体抗原,这种支原体常导致儿童和青少年非典型肺炎。2.3外源蛋白质的产酶融合T4噬菌体基因组DNA为双链线形,呈环状排列,并且噬菌体衣壳的外表面包被着2种非必需外壳蛋白:SOC(smalloutercapsidprotein)和HOC(highlyantigenicoutercapsidprotein)。T4噬菌体表面展示是将外源多肽或蛋白质分别与SOC位点的C末端和HOC位点的N末端融合而展示于T4噬菌体表面。SOC位点展示是通过一个重组载体,将融合有外源序列的SOC融合基因同源整合入缺失SOC的T4基因组中,选择恢复溶菌酶生长不依赖性的噬菌体,即可将外源肽或蛋白质展示于噬菌体表面。HOC位点展示则通过体外包装实现,将目的基因连接于hoc基因的C端,构建hoc融合基因表达载体,并在IPTG的诱导下表达HOC融合蛋白。在与HOC蛋白缺失的T4噬菌体突变株共感染时,将HOC融合蛋白包装到T4噬菌体衣壳表面的HOC位点,实现外源蛋白质在T4噬菌体的HOC位点的展示。若将SOC与外源蛋白质的融合基因整合入噬菌体基因组中,再取已经整合了外源基因的噬菌体按HOC位点展示的方法进行HOC位点体外包装,就可实现SOC、HOC双位点的同时展示。此外,T4噬菌体的扁长型二十面体衣壳,使其系统容量大,可以体外组装,拷贝数高。2.4噬菌体展示系统T7噬菌体基因组为线性双链DNA,其衣壳蛋白通常有两种形式,即10A(344个氨基酸残基)和10B(397个氨基酸残基),10B衣壳蛋白区存在于噬菌体表面,所以被用作噬菌体展示。T7噬菌体展示系统可以高拷贝量展示50个氨基酸的多肽,以低拷贝量(0.1~1/噬菌体)或以中拷贝量(5~15/噬菌体)展示1200个氨基酸残基的多肽或蛋白质,分别与相应亲和力区域结合,其实用性较强。并且T7噬菌体展示系统是通过C端融合表达蛋白,插入片段被克隆到T7噬菌体载体基因10B的C端。因此,即使插入片段内含有终止密码子,同样也可以被其表达和展示。T7噬菌体作为一种高效的展示工具,已广泛用于蛋白质的研究中,近来更是发现T7噬菌体展示工具可通过单循环高效的亲和选择结合蛋白或特异肽。3.中融合酶的发现技术在蛋白质研究中的应用3.1蛋白质修饰噬菌体随机展示文库技术被广泛应用于研究蛋白质与其他配基的相互作用。完整的蛋白质或结构域与噬菌体蛋白形成融合噬菌体,为研究结构与功能的相互关系提供了一个非常有效的工具。并且,展示大的多肽片段不是受限于插入序列的大小,而是依赖于这些蛋白质是否具有通过宿主菌(E.coli)内蛋白质修饰或提高蛋白质的结合能力或催化能力。近来,已经从展示文库中获得许多具有价值的蛋白质,如通过噬菌体展示对T细胞受体可变区域结构特性的研究,此可变区有利于加强区域稳定性和VαVβ等单链片段的表达。谷氨酸结合肽1(QBP1)也在噬菌体表面以生物活性方式表达,发现QBP1可结合致病的谷氨酸蛋白,从而抑制推迟神经组织退化等。研究这些蛋白质的功能对人类疾病的治疗和药物开发有着重要的意义。当蛋白质或功能亚基被表达于噬菌体表面,插入蛋白质的天然的四级结构就提供了一个具有广泛突变位点的用来限制折叠的框架。如许多真核生物的转录因子具有锌指结构,每个部位与DNA靶位点上的3个碱基对作用,其中没有固定的规律。在锌指与DNA作用的方面,通过锌指做框架,能够筛选出与新的寡聚核苷酸相互作用的嵌合噬菌体。3.3噬菌体展示技术蛋白质的相互作用是生命过程中所不可缺少的,噬菌体展示的多肽文库是由特定长度的随机短肽序列组成。用靶蛋白质(如受体、抗体等)对该随机文库进行亲和淘筛,就可以获得与之结合的短肽序列。对所得序列测定分析,并合成相应的短肽,从而可以来研究两个蛋白质之间的相互作用。噬菌体展示技术和蛋白质水解作用相结合可筛选稳定折叠的蛋白质,这种方法不依赖蛋白的特异性,理论上适用于任何蛋白质。应用此种方法生产的高适温性蛋白(hyperthermophilicprotein),可使多肽片段形成新的折叠结构域或使部分折叠区完全折叠。利用这种方法已经成功鉴定出多个重要大分子,如生长激素受体、胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体和TNF-α受体的激动剂和颉颃剂等。近年来,噬菌体展示技术已经用于高效的探测蛋白质的相互作用,尤其是T7噬菌体展示系统的运用,其目的是发现蛋白质相互作用的小分子抑制剂,从而用于各种疾病的治疗。这些研究表明,噬菌体展示技术可用于阐明受体的分子结构,以位点特异的方式确认其生物活性所需要的关键区域。3.4基于序列的点分子身份证构建的基因序列可利用靶蛋白质从蛋白质随机展示文库中筛选一个与其相互作用的蛋白质,并定点突变,以实现对其特定位点和功能域进行定向选择。因此定点突变结合噬菌体展示技术成了筛选蛋白功能域的一个有力工具。蛋白质的定向改造指的是用盒式突变、错误倾向PCR等方法来突变蛋白质或结构域的某一特定编码序列,产生蛋白质或结构域的突变文库呈现在噬菌体表面,通过亲和筛选获得所需的已定向改变的噬菌体克隆,其一级结构可以从DNA序列中推导出来,可用来筛选具有更强受体结合能力的细胞因子、新的酶抑制剂、转录因子的DNA结合新位点、新的细胞因子拮抗剂、新型酶和增强生物学活性的蛋白质等。利用错配PCR等结合定点突变技术,构建了锌指DNA结合蛋白的噬菌体展示文库,研究有关氨基酸残基序列与DNA结合位点之间的识别规则,可以通过设计特异的多肽去控制基因的表达,如近期,对肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF)的研究,已知TNF是抗炎和抗癌药物的重要靶标,在发病过程中起到重要的调控作用,通过对TNF的选择性突变,为TNF受体功能研究提供了有力工具。蛋白质的定向设计可根据人类的需要而广泛运用,对于功能蛋白质的实际应用有着重要的现实意义。3.5病毒前体在细胞生物学和中和性单抗中的应用从多肽库中可分离到与天然激素相似的、与受体结合的高亲和力的多肽,利用完整细胞从多肽库中找到受体的高选择性配体,如利用噬菌体展示技术研究发现,人白细胞介素-4受体(IL-4)作为靶标是对药物筛选,及动脉粥样硬化分子成像的重要工具。用完整的Puumala汉坦病毒淘选一个CX7C多肽库,并利用该病毒的中和性单抗进行竞争性洗脱,所分离的一个多肽能与汉坦病毒结合,并使该病毒不能结合或感染细胞。这个多肽和单抗在体外以相同的有效浓度中和病毒。Shukla等建立了一种快速筛选β-内酰氨酶配体的方法,筛选出的β-内酰氨酶配体作为一种头孢菌素类药物前体在病毒导向的酶解药物前体疗法治疗肿瘤方面具有较大潜力。用这种类似方法可以得到更多用于肿瘤酶解药物前体疗法治疗的药物分子。Jager等利用噬菌体展示技术筛选出了非白血性白血病相关的配体。除了配体的筛选外,噬菌体展示亦可高效筛选出各种受体,并有效地研究其功能。如He等运用优化的T7cDNA噬菌体展示文库对多个受体的天然产物同时进行验证,并用环孢霉素作为亲和探针进行靶蛋白的筛选,从而为多个受体天然产物的研究奠定了重要基础。利用噬菌体展示技术不仅可以发现新的受体和配体,对受体与配体间相互作用的研究也起到重要作用,为相关疾病的基因治疗和药物设计奠定了重要基础。3.6fabg抑制剂Kristan等通过噬菌体展示文库结合并筛选出β-酮脂酰-ACP还原酶(FabG)的抑制剂。已知该酶是原核生物脂肪酸生物合成代谢中高度保守和广泛存在的酶,因此,β-酮脂酰-ACP还原酶可作为新型抗菌剂开发的靶标。噬菌体展示技术为其抑制剂的研究提供了有力平台,如许多从大肠杆菌中筛选出的反式肉桂酸的衍生物就被作为FabG的抑制剂,用于抑制其活性。Dennis等从噬菌体肽库中筛选到能非竞争地抑制凝血因子(FactorVIIa,FVIIa)活性的肽段,该肽段有很高的特异性和很强的亲和性,对其结构的分析表明,此肽段结合在已知活性位点之外的区域,肽段与此位点结合后通过别构效应来抑制FVIIa的活性。利用噬菌体展示技术,以黑曲霉葡萄糖淀粉酶为靶分子,从噬菌体多肽库中经过3轮生物淘选筛选得到3个特异性结合的噬菌体克隆,化学合成了环状多肽,其序列对应结合力最强的一个克隆为GB1的N端10个氨基酸残基,该多肽可以竞争性地抑制黑曲霉葡萄糖淀粉酶以及大鼠小肠的α-葡萄糖苷酶。目前,已针对乙酰胆碱酯酶、海藻糖酶、乙酰乳酸合成酶、乙酰CoA羧化酶和谷氨酰胺合成酶等靶标酶,开发和研制了一系列高效的杀虫剂和除草剂。噬菌体技术的运用,对各靶标酶抑制剂的筛选奠定了重要基础,对新型农药的开发具起到巨大的作用。3.7最佳模型的确定—研究细胞信号转导噬菌体展示技术还被用于信号转导时分子的识别。钙调蛋白(CaM)在胞内信号传导中作用非常重要,可以和许多靶蛋白或酶结合并调节其功能。实验表明使用含有CaM抑制剂的培养基培养NRK细胞时,将影响周期蛋白依赖性蛋白酶(cdk4、cdk2)的活性。为了进一步研究其功能,运用CaM亲和层析筛选噬菌体展示肽库,获得新的CaM结合蛋白,发现核内核糖体蛋白与CaM相关联,说明CaM与对核糖体的装配和功能起到调节作用,CaM可能调节核的装配和功能。此外,可选用依赖cAMP的蛋白激酶(CAPK)做研究模型,用标记的ATP和CAPK筛选随机5肽库和7肽库可得到CAPK的底物功能片段。3.8噬菌体展示技术抗原表位分析技术是以单克隆抗体(mcAb)作为固相筛选分子,加入噬菌体随机多肽库,使其与单抗充分反应,经数轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程,且每次增加筛选强度,用最后一次淘洗的噬菌体感染宿主菌,随机挑选克隆,经噬菌体ELISA鉴定并进行交叉反应实验和竞争抑制性实验,对所选的阳性克隆通过DNA序列分析,就可以知道该噬菌体所携带的外源肽序列,从而得知该单抗针对的特异性抗原表位。如运用噬菌体展示技术对人类嗜T淋巴细胞病毒I(TlymphotropicvirustypeI,HTLV-I)相关脊髓病脑脊液中免疫球蛋白G(immunoglobulinG,IgG)的抗原表位分析。该技术在揭示抗原分子的结构和功能,抗原-抗体反应机制方面具有重要意义,亦为研制诊断试剂,设计多肽疫苗和筛选药物等研究提供依据。此外,研究发现噬菌体展示模拟表位比天然表位诱发的抗体活性高3倍,这表明此模拟表位噬菌体可以作为肿瘤疫苗用于预防和治疗肿瘤。4.噬菌体展示技术的局限性综上所述,噬菌体展示技术在蛋白质应用研究方面显示出极大的实用性,因其能够有效地实现基因型和表现型的体外转换,使研究者可以在基因分子克隆的基础上,较准确地实现蛋白质构象的体外控制,从而可获得具有良好生物活性的表达产物。尤其是T7噬菌体展示系统,由于其特有的优点,已成为目前运用最为广泛的噬菌体展示系统。但是这项技术仍存在着自身的局限性,主要表现在以下几方面:(1)受大肠杆菌转化效率的的限