超声辅助酶法制备燕麦ace抑制肽的研究

超声辅助酶法制备燕麦ace抑制肽的研究

小麦是小麦加工过程中的辅助产品，含有大量的蛋白质含量（15%30%）。结果表明，小麦蛋白质是优质谷物蛋白，氨基酸比例合理。ACE抑制肽是一类对ACE有抑制作用的多肽,通过与ACE结合,阻止血管紧张素I转化为血管紧张素II,同时增加舒缓肽和脑啡肽的水平,从而达到降压的作用。传统ACE抑制肽的生产主要是采用蛋白酶水解的方法,但这种方法反应速度较慢,而利用超声波物理场破坏大分子物质分子结构或改变分子空间构型来改变生物活性,或者使生物大分子物质易于降解,经过超声波处理后再利用酶解方法处理,不仅可以促进酶解进程,而且可以获得高活性的酶解产物。本研究利用超声辅助酶法制备燕麦ACE抑制肽,探讨超声波处理与酶解处理中的各种条件及各蛋白酶水解燕麦蛋白的最佳条件,以对血管紧张素转化酶抑制作用为指标,利用响应面法超声波辅助酶法制备燕麦ACE抑制肽的最佳工艺。1材料和方法1.1zityes公司的纺粘设备燕麦麸皮河北省张家口农科院燕麦研究所。Alcalase酶(食品级)Novozymes公司;血管紧张素转化酶(angiotensinconvertingenzyme,ACE)(0.1U/mg)、马尿酰组氨酰亮氨酸(N-hippuryl-his-leuhydrate,HHL)Sigma公司。1.2水浴升温振荡江苏khzJXD-02型超声波电源(28、40、50、135kHz)北京金星超声波设备技术有限公司;DSHZ-300多用途水浴恒温振荡器江苏太仓市实验设备厂;T6新世纪紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限公司。1.3方法1.3.1检测方法1.3.1.肽键物质的量采用OPA法测定。式中:h为水解后每克蛋白质裂解的肽键物质的量(mmol/g);htot为每克原料蛋白质的肽键物质的量(mmol/g),原料蛋白质中肽键被裂解的百分数表示蛋白质被酶催化降解的程度。1.3.1.2.多酚含量采用Folin-酚法测定。1.3.1.ab对aa抑制肽的抑制率采用体外检测方法。取5mmol/LHHL(hip-his-leu)溶液80μl(pH8.3,含0.3mol/LNaCl)与40μlACE抑制肽混合。37℃水浴预热5min后,加入0.1U/mlACE溶液10μl,继续37℃水浴30min。随后加入1mol/LHCl溶液200μl终止反应。再加入1.2ml乙酸乙酯均匀混合15s,以萃取反应体系中的马尿酸。1000×g离心10min后取出0.9ml酯层溶液转入另一试管中,80℃烘干,并重新溶于3ml去离子水中,在228nm波长处测定吸光度。ACE抑制率如下式计算:式中:Aa为ACE及ACE抑制肽都存在条件下的吸光度;Ab为不存在ACE抑制肽条件下的吸光度;Ac为ACE不参与反应条件下的吸光度。1.3.2超声波辅助酶解燕麦阿斯匹林的影响将燕麦麸皮(20~60目过筛,粒径在0.250~0.850mm范围内)按一定料水比配制,分别利用超声波辅助方法与传统方法酶解方法比较,比较酶解产物的ACE抑制活性和水解度,从而比较超声波辅助酶法与传统酶法制备燕麦ACE抑制肽的优势。1.3.2.ph值对alcarlo-4和alcarase酶活性的影响称取一定量燕麦麸皮按料水比为1:10(m/V)配制,放入塑料容器中,用1mol/LNaOH将燕麦麸皮液的pH值调至11,利用超声波对燕麦麸皮液进行预处理30min(超声波水浴温度55℃,超声波频率40kHz,超声波功率154W),测定pH值(测定值为8.2,与Alcalase酶反应的最适pH值基本一致),之后按酶与底物比为5%添加Alcalase酶,继续在55℃水浴中反应2h,随后在85℃下灭酶10min。之后在12000r/min条件下离心5min,所得上清液(尽量除去离心液表面上的油脂)进行抽滤,所得酶解液测定水解度,并对其进行冷冻干燥,所得燕麦多肽粉末按蛋白浓度为8mg/ml配制溶液,进一步测定其ACE抑制活性。1.3.2.燕麦麸皮液ph值对alcarlo为酶反应的最适ph值的影响其他条件不变,预处理前不调pH值,当用超声波预处理后,用1mol/LNaOH将燕麦麸皮液的pH值调至8.5(Alcalase酶反应的最适pH值),之后条件同1.3.2.1节。1.3.2.燕麦麸皮ph的预处理配制好的燕麦麸皮液放入塑料容器中,用1mol/LNaOH将燕麦麸皮液的pH值调至11,在55℃水浴下进行预处理30min,之后条件同1.3.2.1节。1.3.2.超声波辅助中燕麦麸皮液的制备配制好的燕麦麸皮液用1mol/LNaOH将燕麦麸皮液的pH值调至8.5(Alcalase酶反应的最适pH值),之后按按酶与底物比为5%添加Alcalase酶,利用超声波对燕麦麸皮液进行处理2.5h(水浴温度55℃,超声波频率40kHz,超声波功率154W),之后条件同1.3.2.1节。1.3.3超声波预处理及酶解过程中的影响将燕麦麸皮(20~60目过筛,粒径为0.250~0.850mm)按一定料水比1:10配制,用1mol/LNaOH将燕麦麸皮液的pH值调至11,利用超声波进行预处理,随后Alcalase酶在55℃(反应最适温度)进行酶解,制备具有ACE抑制活性的燕麦多肽产物。在超声波预处理过程中比较超声波处理时间、超声波频率、超声波功率及超声波水浴温度对多肽制备的影响,在酶解过程中比较酶解时间及加酶量对多肽制备的影响。实验中利用产物对ACE抑制率及蛋白质水解度作为指标验证制备效果。1.3.4响应面优化试验在单因素试验的基础上,根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理,以ACE抑制率为响应值,通过响应面曲面分析进行制备条件的优化,并运用SAS8.0软件分析得到最优制备条件。2结果与分析2.1ce抑制肽和超声波处理ce抑制剂从图1可以看出,超声波辅助酶法制备燕麦ACE抑制肽,在水解度和ACE抑制率上均高于传统水浴酶解方法制备的燕麦ACE抑制肽,但是不能用超声波直接处理酶解液,因为超声波会使蛋白酶结构发生破坏,使酶失活,因此其水解度和ACE抑制率值非常低;超声波辅助酶法制备燕麦ACE抑制肽两种方法比较可以看出,如果在超声波预处理前,调节燕麦麸皮液pH值为碱性时,制备的燕麦多肽其ACE抑制率和水解度均高于不调节pH值的燕麦多肽,因此为后续实验确定了实验步骤。2.2超声辅助酶法制备了燕尾醇单元素试验2.2.1超声时间对燕麦多肽水解度和优化抑制率的影响如1.3.2.1节所示方法,其他条件不变,选择超声处理时间为0、10、20、30、40、50min和60min进行比较,结果见图2。从图2可以看出,随着超声时间的增加,燕麦多肽的水解度和ACE抑制率的变化并未呈现相关性。当超声时间为50min时水解度达到最高值16.53%,而其ACE抑制率并不高只有68.32%。而当超声时间30min,水解度只有14.73%,而ACE抑制率却达到了80.45%,为实验中最高。水解度值最高时,ACE抑制率并不是最高的。为了达到较高的ACE抑制率,实验选取超声处理时间为30min。2.2.2不同频率对燕麦多肽水解的影响固定超声波处理时间后,其他条件不变,选择超声波频率为28、40、50、135、(28+40)kHz和(50+135)kHz6种频率进行比较,结果如图3。从图3可以看出,总体讲,几种超声频率处理后的燕麦多肽水解度相差不大,但是频率的变化对ACE抑制率影响较大,当频率为50kHz时ACE抑制率达到84.48%,为最高值;而当频率为135kHz时ACE抑制率仅为69.93%。为了得到效果较好的ACE抑制肽,选择超声波频率为50kHz。2.2.3个别值对阿斯匹林阿斯匹克单元溶液合成的影响固定超声波功率后其他条件不变,研究超声波功率44、88、132、176W和220W五个值对ACE抑制肽制备的影响,结果如图4。从图4可以看出,燕麦多肽的水解度值,先随着功率的增加而上升,在功率为88W达到最大值17.11%,而多肽的ACE抑制率在当功率为176W时达到最大值,抑制率为88.9%,因此选择超声波功率为176W进行后续实验。2.2.4温度对水解度和阿斯匹林异性对实验结果的影响固定超声波功率后其他条件不变,选择超声波水浴温度为45、50、55、60℃及65℃进行研究,确定最佳温度,实验结果见图5。从图5可以看出,温度的变化对水解度和ACE抑制率均有较大的影响,随着温度的变化,水解度和ACE抑制率的变化趋势基本一致,随着温度的增加,两者呈现先降低后上升的趋势。当温度达到55℃时,水解度和ACE抑制率均达到最大值,而在65℃时两者均达到最小值。因此实验选择的超声波水浴温度为55℃。2.2.5酶解时间对水解度的影响固定超声波水浴温度后其他条件不变,选择酶解时间为1、2、3h和4h进行比较,实验结果如图6。从图6可以看出,水解度随着酶解时间的延长水解度先变大再减少,在3h时达到最大值,而当时间为4h,水解度开始减少,可能是其中一些成分随着时间延长发生了变化。ACE抑制率并未呈现此变化,ACE抑制率在2h达到最大值,出于ACE抑制率活性较好,且生产效率较高的原因,选择酶解时间为2h。2.2.6不同酶解效果的确定固定超声波水浴温度后其他条件不变,研究加酶量,按酶与底物比为1%、3%、5%和7%进行比较,得到较好的酶解效果,结果见图7。从图7可以看出,加酶量的增加对于水解度和ACE抑制率的影响较为明显,随着加酶量的增加水解度也不断增加,当加酶量到5%时增加趋势变缓;ACE抑制率随着加酶量的增加呈现先增加后降低的趋势,在5%时达到最大值,由于其ACE抑制率较高,而且还能节约生产成本,因此选择加酶量为5%。2.3应用超声波辅助酶法研究了燕尾醇的最佳制备工艺2.3.1响应面优化试验根据单因素试验结果,采用响应面设计试验,运用根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理,选择对ACE抑制率有显著影响的四个因素:超声波处理时间(X1)、超声波功率(X2)、超声波水浴温度(X3)和酶解时间(X4),进行四因素三水平的响应面分析实验,本研究以ACE抑制率为响应变量,见表1。2.3.2响应面方程的交互作用通过SAS8.0软件进行表2二次响应面回归分析,得到如下多元二次响应面回归模型:从表3方差分析可以得出ACE抑制率方程的一次项和二次项极其显著,说明各具体因素对响应值的影响不是简单的一次线性关系。交互项极其显著,因此说明各因素之间的交互作用很好,整个响应面基于各因素间的交互作用构成。另外,总回归项极其显著证明回归方程拟合程度较好,说明实验具有很高的可信性和准确性;失拟项极其不显著,因此说明实验的误差很小。2.3.3结果图12做出响应曲面,分析超声波处理时间(X1)、超声波功率(X2)、超声波水浴温度(X3)和酶解时间(X4)对ACE抑制率的影响情况,结果见图8~13。通过SAS8.0软件分析,由响应曲面和等高线图以及回归方程分析可知,ACE抑制肽最佳制备条件为:超声波处理时间28.40min、超声波功率190.08W、超声波水浴温度55.05℃、酶解时间2.25h,按上述优化条件做验证实验,制备燕麦ACE抑制肽测定ACE抑制率为87.50%(燕麦多肽干燥后粉末按多肽质量浓度为8mg/ml配制水溶液后测定ACE抑制率)。3响应面试验结果3.1确定了超声波辅助酶法与传统方法在提取ACE抑制肽的优势;经过单因素试验初步确定反应了反应条件超声波处理时间30min、超声波频率50kHz、超声波功率176W、超声波水浴温度55℃、酶解时间2h、加酶量5%。3.2利用响应面设计实验,运用根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理,选择对ACE抑制率有显著影响的四个因素:超声波处理时间(X1)、超声波功率(X2)、超声波水浴温度(X3)和酶解时间(X4),做四因素三水平的响应面分析试验。最终得到超声波处理时间28.40m