天然多肽类化合物的分离与鉴定

天然多肽类化合物的分离与鉴定

多媒体化合物广泛存在于自然界。天然产物中已知的活性多肽主要是由生物体分泌细胞、内分泌腺组织器官、体液或胞质中产生或获得的,生命活动中的多种生理功能均与活性多肽密切相关。随着分离纯化技术和结构鉴定等研究方法的飞速发展,越来越多的具有某种生物活性及药用价值的天然多肽类化合物被分离鉴定出来。本文将从多肽类物质的分离纯化和鉴定方法着手,对近几年的色谱法、电泳、质谱及核磁共振等方法在多肽类物质研究中的最新应用进展作一综述。1常用的提取工艺多肽类物质种类繁多,实际的分离和纯化工作需要根据其各自不同的理化性质选择不同的纯化方法,常用的包括冻融法、酶解法、盐析法、超滤法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、聚乙二醇沉淀法、凝胶过滤法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、疏水层析、逆流分溶等。这些方法常常组合到一起对特定的多肽进行分离纯化,同时其中的一些方法也可用于多肽类物质的分析,现举例如下:1.1色度法1.1.1反相高效液相色谱高效液相色谱(HPLC)的出现不仅是药物研发领域的革命,同时也为多肽类物质的分离提供了更有利的方法。在适宜的色谱条件下应用HPLC可以在短时间内完成对蛋白质、多肽的分离,更重要的是HPLC能在制备规模上生产具有生物活性的多肽。在多肽的分离、纯化和鉴定中应用最多的是反相高效液相色谱(RP-HPLC),约95%是C18反相硅胶HPLC。其原理是基于多肽的疏水性,在不同介质条件下,使不同的多肽得以分离,具有快速、高效和高回收的特点,在分离和制备多肽及蛋白质上有独特的优越性。利用RP-HPLC分离多肽时,首先要确定不同结构的多肽在柱上的保留情况。为了获得一系列的保留系数,Wilce等利用多线性回归方法对2106种肽的保留性质与结构进行分析,得出了不同氨基酸组成对保留系数影响的关系,其中极性氨基酸残基在2~20氨基酸组成的肽中,可减少在柱上的保留时间;在10~60氨基酸组成的肽中,非极性氨基酸较多也可减少在柱上的保留时间,而含5~25个氨基酸的小肽中,非极性氨基酸增加可延长在柱上的保留时间。同时,亦有文献报道了肽链长度、氨基酸组成、温度等条件对保留情况的影响,并利用计算机处理分析得到每种多肽的分离提取的最佳条件。1.1.2层析或凝胶色谱分子排阻色谱(Sizs-Exclusionchromatography,SEC)又称分子筛层析或凝胶色谱,是利用多肽分子大小、形状差异来分离纯化多肽物质,因此对分离一些较大聚集态分子十分方便。如人重组生长激素的分离,不同结构、构型的生长激素(GH)在SEC柱上分离行为完全不同,从而可分离不同构型或在氨基酸序列上有微小差异的变异体,一些分子量较大的肽可利用此法进行分离分析。1.1.3活性多肽的分离纯化离子交换色谱(Iron-Exchangechromatography,IEXC)是根据物质的带电性质及带电数量的不同而进行分离的一种层析技术,同时也是活性多肽分离纯化过程中使用最广泛的色谱技术,分为阳离子柱与阴离子柱两大类。在多肽类物质的分离分析研究中,对多肽的性质、洗脱剂、洗脱条件的研究较多,不同的多肽分离条件有所不同,特别是洗脱剂的离子强度、盐浓度等对纯化影响较大。IEXC最适用于早期纯化阶段。一般情况下,粗胶粒的离子交换剂用在提纯的前面步骤中,高分辨率的离子交换剂则用在纯化的后面步骤中。1.1.4鸡中的小疏水作用多肽中一般都含有疏水基团,疏水色谱(Hydrophobicinteractionchromatography,HIC)是利用多肽中含有的疏水基团可与固定相之间产生疏水作用而达到分离分析的目的,与RP-HPLC相比,HIC具有较少使多肽变性的特点。1.1.5线性层析技术高效置换色谱(High-PerformanceDisplacementChromatography,HPDC)利用一种非线性层析技术,借助小分子高效置换剂来交换色谱柱上的样品,从而达到分离的目的。它具有分离组分含量较少成分的特性,与传统的洗脱层析技术相比有着明显优点,即高上样量、高产率、高分辨率,以及被分离样品在分离过程中的浓缩效应,这一技术已越来越引起人们的关注。研究表明,置换剂的相对分子质量越低,越易于与固定相结合,因此在分离相对分子质量小的多肽时,需要更小的置换剂才能将其置换纯化出来。1.2分析与法1.2.1单抗类物质分离亲和层析(Affinitychromatography,AC)是利用固定相配基与其特异性配体之间的特异亲和性而分离物质的层析方法。按照特异亲和作用分为抗原-抗体、酶-底物、凝集素-多糖、寡核苷酸与其互补链等。对多肽类物质分离目前主要应用其单抗或生物模拟配基与其亲和,这些配基有天然的,也有根据其结构人工合成的。在寻找到合适组合后,利用AC法从粗提液中可只经一次简单的处理便可得到所需的高浓度活性物质。1.2.2mecc的基本原理胶束电动毛细管层析(Micellarelectrokineticelectrophoresischromatography,MECC)的原理是在电泳液中加入表面活性剂,如十二烷基磺酸钠(SDS),使一些中性分子带相同电荷分子得以分离。特别对一些小分子肽,阴离子、阳离子表面活性剂的应用都可使之形成带有一定电荷的胶束,从而获得很好的分离效果。1.3电泳法1.3.1ceco-hplc毛细管电泳(Capillaryelectrophoresis,CE)是利用小的毛细管代替传统的大电泳槽,使电泳效率提高几十倍。此技术从20世纪80年代以来发展迅速,是生物化学分析工作者分离、定性多肽与蛋白类物质的有利工具。应用CE分离多肽类物质具有柱效高、分析时间短、所用样品量和试剂少等优点。与HPLC相比,CE的制备总量低,适用于微量制备;对扩散系数小的生物大分子而言,CE比HPLC的分辨率高得多,因此CE被用来作为收集非常纯的单一馏分的微量制备手段。常用的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、CE在纯化蛋白方面得到了很好的应用。CE根据应用原理不同可分为毛细管区带电泳(Capillaryzoneelectrophoresis,CZE)、毛细管等电聚焦电泳(Capillaryisoeletricfocusing,CIEF)、毛细管凝胶电泳(Capillarygelelectrophoresis,CGE)和MECC几种。1.3.2cze分离型多肽药物CZE分离多肽类物质主要是依据不同组分中的化合物所带电性决定,比传统凝胶电泳更准确。目前存在于CZE分离分析多肽物质的主要问题是天然蛋白或肽,易与毛细管硅胶柱上的硅醇基发生反应,影响峰形与电泳时间。针对这些问题不少学者做了大量的改进实验,如调节电泳液的pH值,使与硅醇反应的极性基团减少;改进毛细管柱材料的组成,针对多肽性质的不同采取不同的CZE方法。1.3.3sds分子筛CGE是一类以毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。它基于分子筛原理,经SDS处理的蛋白或多肽在电泳过程中主要靠分子形状、分子量不同而分离。目前,又有一种非交联、线性、疏水多聚凝胶柱被用于多肽类物质的分离分析,此电泳法适于含疏水侧链较多的肽分离。1.4分离、分析混合多肽中的应用不同多肽的等电点(PI)不同,在具有不同pH梯度的电泳槽中,特定的多肽可在其等电点pH条件下聚集沉淀下来,而与其它多肽分开。但是由于在CIEF中,柱表面覆盖物的不稳定性,限制了CIEF在分离、分析混合多肽中的应用。除以上提及的分离纯化技术外,另有诸如膜蛋白色谱(Chromatographyofmembraneprotein,CMP)、灌注层析(Perfusionchromatography,PC)和2-D电泳等技术也可行。实际工作中各种纯化方法多相互结合,综合利用多肽的各种性质,采用组合法分离得到目的多肽。2鉴定方法2.1分和结构分析质谱分析(Massspectrometry,MS)是20世纪60年代发展起来的结构测定方法,它可将化合物形成离子和碎片离子,按其质荷比的不同进行分离测定,进而进行成分和结构分析,该方法在蛋白、多肽分析中已经得到了广泛应用。连续流快原子轰击质谱(Continuous-flowfastatombombardment,cf-FAB)、电雾离子化质谱(Electrosprayionization,EIS)、基质辅助激光解析/离子化-飞行时间质谱(Matrix-associatediaserdisso-ciation/ionizationtimeofflightmassspectrometry,MALDI-TOFMS)是近几年在多肽分析方面应用得较多的新方法。2.1.1速中性原子击穿聚集态cf-FAB在室温条件下,以甘油等极性化合物作溶剂,用快速中性原子轰击聚集态样品,是一种弱离子化技术,主要用于极性强、难挥发、分子量大的样品的分析。可将肽类或小分子量蛋白离子化成[MH]+或(M-H)形式。cfFABHPLC、CZE。2.1.2荷电离子和分子量的测定蛋白或多肽经过一定的处理,如在液相色谱中经有机溶剂的洗脱,可被部分质子化,在EIS腔内可形成[MH]+、[M2H]2+等一系列荷电离子,依此蛋白或多肽便可在质谱仪内分析记录,测定分子量。利用EIS与HPLC联合分离分析GH和血红蛋白均获成功,其也可与CZE联合应用。2.1.3效率鉴定多肽物质其是目前蛋白质组学研究的必备工具,能精确测定多肽的相对分子质量,结合液相色谱的联用技术可以高效率地鉴定多肽物质。不但可得到多肽的相对分子质量信息,还可测定它们的序列结构,此项技术将在未来蛋白质组学研究中起到决定性作用。2.2nmr的应用近年来,随着二维、三维以及四维核磁共振(Nuclearmagn_eticresonance,NMR)的应用,分子生物学、计算机处理技术的发展,使NMR逐渐成为多肽类物质分析的主要方法之一。NMR可用于确定氨基酸序列、定量混合物中的各组分组成含量等。目前,NMR在分析分子中含少于30个氨基酸的小肽时是非常有用,可达到快速准确分析的目的。2.3na的推导用Edman反复降解法对氨基酸进行部分序列分析,再用cDNA的推导就可以完善多肽序列。除上述方法之外,圆二色谱、场解析质谱、红外光谱、紫外光谱、生物鉴定法、放射性同位素标记法及免疫学方法等都已应用于多肽类物质的结果鉴定、分析检测之中。3多种方法组合的应用和成本提高原因得益于上述诸多多肽分离纯化和鉴定方法的应用与改进,越来越多的具有生物活性及药用价值的天然多肽类化合物被分离鉴定出