固态发酵产菜籽蛋白肽菌种的筛选

固态发酵产菜籽蛋白肽菌种的筛选

蔡棉碗是生产蔡棉油的副产品，含有35%4%的粗蛋白素。这是重要的植物蛋白质资源。菜籽蛋白是一种优质蛋白质,氨基酸组成符合FAO/WHO推荐模式值。因菜籽粕中含有硫甙、芥子酸等抗营养成分,使菜籽饼粕作为植物蛋白资源在食品工业中的应用受到限制。长期以来,对食物蛋白进行水解改性是食品领域的研究热点,因为,菜籽蛋白水解成多肽或氨基酸后,具有更好的生物活性和加工特性。生物固态发酵法生产大豆肽的研究在我国已有报道,而固态发酵法生产菜籽肽的研究甚少,如果能筛选到产蛋白酶,水解菜籽蛋白效果较好的微生物,用于菜籽粕发酵,将有可能成为生产菜籽肽的新途径。本实验以黑曲霉、白地霉、宇佐美曲霉、雅致放射毛霉、产朊假丝酵母、地衣芽孢杆菌、米曲霉和枯草芽孢杆菌为出发菌株,菜籽粕为原料,对固态发酵生产菜籽肽的不同菌种作用效果进行了比较研究,筛选出用于固态发酵生产菜籽肽的优良菌种,为今后的进一步研究打下了基础。1材料和方法1.1蛋白、氨基酸Bacillus.subtilis10160等产蛋白酶菌种中国工业微生物菌种保藏中心;菜籽粕:以canola菜籽为原料,通过浸提脱油制得,粗蛋白含量42.15%,换算系数为6.25,水分8.48%;牛血清白蛋白、细胞色素、钴胺酰胺(VB12)、Gly-Gly-Tyr-ArgSigma公司;其他试剂均为分析纯。1.2仪器和检测仪器立式电热压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂;超净工作台苏净集团安泰公司;pHS-3C型精密数显pH计、722N紫外可见分光光度计上海精密科学仪器厂;GL-20B型高速冷冻离心机上海安亭科学仪器厂;PQX型多段可编程培养箱宁波东南仪器有限公司;AKTA蛋白质纯化仪通用电气公司。1.3方法1.3.1悬浮液的制备从种子培养基中(按菌种说明书制备)取一定量的孢子和细胞于无菌水中,调节细胞浓度为3×106个/ml。1.3.2培养菌种、时间把制备好的菌悬液接入已灭菌固态发酵培养基中,使基质含水量为55%(霉菌培养基)、65%(细菌、酵母培养基)。调培养箱温度30℃,湿度90%,定时搅拌通气,培养一定时间后取样测定。发酵培养基:菜籽粕10g,自然pH值。1.3.3离心汁ml发酵后的固态基质,加蒸馏水定容至200ml,搅拌30min,2~4℃下5000×g离心15min;用0.45μm微孔滤膜过滤上清液,除去不溶物和细菌,备用。1.3.4干草芽数测定血球板计数法测定。1.3.5氮溶解指数的测定按照文献所述方法进行测定。1.3.6测定氨基酸氮的条件按照文献所述方法进行测定。1.3.7tca-2-双缩哌-1-甲基-5-甲基苯磺酸酯tba-5-甲基苯磺酸酯zea法参照文献所述方法,取一定量处理液,加入等体积10%的三氯乙酸(TCA),静置30min,2~4℃下,5000×g离心15min,取2ml上清液,加8ml双缩脲试剂,25℃下静置30min,测OD540nm值。肽得率按公式(1)计算:1.3.8folin-酚法以酪蛋白(2%)为底物,按国标SB/T10317-1999,采用Folin-酚法测定。40℃下,以每分钟1ml酶溶液水解酪蛋白产生1μg的TCA可溶酪氨酸的酶量定义为1个酶活力单位。1.3.9牛血清微量元素水平采用凝胶过滤色谱法测定。色谱条件:Superose1210/300GL(10×300mm)柱;流动相50mmol/L磷酸盐缓冲液pH7.0,0.15mmol/LNaCl;流速0.5ml/min;进样体积500μl;检测波长215nm。分子量标品为牛血清白蛋白(67000D)、细胞色素(12700D)、钴胺酰胺(VB12,1355D)、Gly-Gly-Tyr-Arg(451.48D)。处理液稀释5倍后测量。1.4处理数据数据均采用平均数±标准差来表示;用t检验进行显著性检验。2结果与分析固态发酵产蛋白酶实验室小试一般因3~5d效果较好;因此,本实验测量了发酵3d和5d的相关数据。2.1蛋白质水解对菜籽粕可溶性氮的影响由图1可以看出,微生物发酵菜籽粕过程中,氮溶解指数随发酵时间的延长都略有升高。原因是在菌体生长过程中,产生的蛋白酶将菜籽粕中不易溶于水的蛋白质水解成易溶于水的多肽和氨基酸,相应地,水溶性氮含量随之上升。其中宇佐美曲霉、雅致放射毛霉和枯草芽孢杆菌发酵效果比较明显,氮溶解指数都超过了65%,黑曲霉、地衣芽孢杆菌和米曲霉次之,而白地霉和产朊假丝酵母的发酵几乎没有促进菜籽粕中的蛋白质的溶解,氮溶解指数与原样相比变化不大,原因可能是菜籽粕中存在不利于这几种菌种生长和产酶的因子。2.2枯草芽孢杆菌发酵过程中氨基酸态氮的变化图2显示了随发酵时间的延长,氨基酸态氮的变化趋势与氮溶解指数一致;但是,与霉菌发酵相比,枯草芽孢杆菌发酵后的氨基酸态氮比较低,原因可能是霉菌产的蛋白酶类大多是外切酶,水解过程中产生了较多的氨基酸,而芽孢杆菌所产的蛋白酶是内切酶,把蛋白质水解成小分子肽,暴露在外的氨基端相对较少。从不同菌种发酵后氨基酸态氮的大小可以看出宇佐美曲霉、雅致放射毛霉较有利于发酵。2.3发酵肽得率的测定肽得率显示发酵后处理液中低分子量菜籽蛋白肽含量的高低。图3说明不同菌种发酵菜籽粕后多肽得率的大小,可以看出,宇佐美曲霉、雅致放射毛霉和枯草芽孢杆菌发酵的肽得率明显高于其他菌种。肽得率随时间的延长变化不大,雅致放射毛霉和产朊假丝酵母发酵的菜籽肽得率随时间延长略有降低,可能是多肽在外切酶的作用下被进一步水解成游离氨基酸的缘故。2.4产蛋白酶的酶活力对不同菌种发酵产蛋白酶活力的研究可以看出(图4),发酵后米曲霉产蛋白酶的酶活力最大,发酵5d为3560U/ml,雅致放射毛霉和枯草芽孢杆菌产蛋白酶的酶活力相对较大。从以上指标可以看出,米曲霉虽然产蛋白酶的酶活力较高,但该蛋白酶类可能只是端切酶,水解蛋白产生了较多的氨基酸。2.5蛋白肽分子量的变化情况为了进一步了解微生物发酵菜籽粕生产菜籽肽的具体水解机制,对上述分析结果中发酵效果较好的6个菌种发酵5d后的处理液,用凝胶过滤色谱研究蛋白肽分子量的变化情况,结果见图5。从图中可以看出,黑曲霉、米曲霉、宇佐美曲霉发酵后产生了较多的中高分子量的物质,宇佐美曲霉发酵液中紫外吸收较强,产量较高;地衣芽孢杆菌、雅致放射毛霉和枯草芽孢杆菌的发酵则产生了较多的低分子量多肽,其中雅致放射毛霉和枯草芽孢杆菌发酵后低分子量多肽产量较高,发酵效果较好。色谱法对发酵处理液中物质的分子量分布分析结果与上述化学分析结果一致。3菜籽肽发酵菌种的筛选本研究利用微生物发酵来生产菜籽多肽,主要利用发酵菌株的产酶及其酶解能力。上述分析结果可得出以下结论。黑曲霉、白地霉、产朊假丝酵母和地衣芽孢杆菌不利于在以菜籽粕为基质的培养基中生长和产酶,不能作为固态发酵生产菜籽肽的出发菌株。米曲霉固态发酵后产生了较多的可溶性氮,色谱分析结果表明产生了一种小分子量物质,且产量很高,蛋白酶酶活力也很高,但多肽得率却较低,可以推测其发酵后产生蛋白酶可能是外切酶,作用于菜籽粕后生成了氨基酸,可作为某种特定氨基酸生产的选择菌种。宇佐美曲霉、雅致放射毛霉和枯草芽孢杆菌发酵效果