补脾益气方对脾虚哮喘大鼠模型肺组织lr4表达的影响

补脾益气方对脾虚哮喘大鼠模型肺组织lr4表达的影响

哮喘是临床上常见的慢性呼吸道疾病之一，具有复发的特点。这是一种由各种细胞和炎症因素引起的过敏性疾病。Toll样受体(Toll-likereceptors,TLRs)是介导连接天然免疫和获得性免疫的受体,能够促使多种细胞因子和炎性因子的释放,诱发并加重炎症反应,在调节气道炎症中起着重要的作用,TLR4是属于I型跨膜受体蛋白,在激活天然免疫及入侵的病原体而诱发一系列的炎症反应中起主导作用。TLR4主要分布于巨噬细胞、淋巴细胞及肺、脾、肝和胎盘等组织中。本研究通过观察补脾益气方对脾虚哮喘大鼠模型肺组织TLR4表达的影响,探讨脾虚对哮喘大鼠气道炎症影响机制及补脾益气方对其的调控作用。药模和模型的建立健康雄性Wistar大鼠36只,SPF级,北京维通利华实验动物技术有限公司提供,体质量(200±20)g,周龄6-8周。许可证编号:SCXK(京)2007-0001。卵蛋白(GradeⅡ,批号:A5253,美国Sigma公司);灭活百日咳疫苗(批号:20080501-5,武汉生物制品研究所);氢氧化铝干粉(批号:Sigma-A4682,规格:25g,美国Sigma公司);兔抗大鼠TLR4多克隆抗体(BA1717,武汉博士德生物工程有限公司);RT-PCR试剂盒(DRR019A,大连宝生物工程有限公司)。36只Wistar大鼠按随机数字法分成3组:对照组、脾虚哮喘组、脾虚哮喘治疗组,每组12只。脾虚哮喘组和脾虚哮喘治疗组先参考文献方法,进一步改进建立脾虚模型。然后依据文献方法建立哮喘模型。脾虚哮喘组和脾虚哮喘治疗组连续10d采用饮食不节、苦寒泄下和过度疲劳等方法共同作用建立脾虚大鼠模型。当动物出现体质量下降;饮水增多,食量减少;肛温升高;排便次数增多,便溏;倦怠少动,游泳耐力下降;爱聚堆等变化,提示脾虚造模成功。在脾虚造模成功后,采用卵蛋白致敏和激发的方法建立哮喘模型。在实验的第11、13和15天,腹腔注射抗原液1mL致敏(由卵蛋白100mg、灭活百日咳杆菌疫苗5×109个、氢氧化铝干粉100mg的0.9%氯化钠溶液配制而成)。致敏后第15天开始,将大鼠放入封闭的雾化箱内,1次/d,将1%卵蛋白溶液用超声雾化器喷雾激发,每次30min,连续7d。当激发时大鼠出现呼吸喘促、点头、腹肌抽动等呼吸困难症状提示哮喘模型造模成功。对照组采用等量0.9%氯化钠溶液代替抗原液腹腔注射致敏,激发时以等量的0.9%氯化钠溶液代替卵蛋白溶液进行雾化吸入。造模成功后用补脾益气方药,由补中益气汤合并玉屏风散化裁而成,由黄芪、人参、防风、白术、大枣等9味中药按比例组成,常规煎煮2次,将药液浓缩为1g/mL生药。按照体表面积换算法,折合人的等效剂量的10倍。实验第11天开始对脾虚哮喘治疗组进行灌胃,剂量为1mL/100g体质量,2次/d,共计21d。在给药21d后取材。肺组织标本:20%乌拉坦腹腔注射麻醉大鼠,开胸后结扎右主气管,取出右肺上叶,用预冷的0.9%氯化钠溶液洗去血液,滤纸吸干肺组织表面的水分,称取100mg肺组织,放入液氮中冷冻,转移至-70℃保存,用于逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测TLR4mRNA的表达;取出右肺下叶,用上述同样的方法处理好后,放入4%多聚甲醛中固定,用于免疫组化测定TLR4的蛋白表达。采用Trizol进行肺组织总RNA提取,采用RT-PCR试剂盒分两步进行RT-PCR反应。TLR4的引物序列和内参照β-actin序列见表1。反应条件:94℃预变性2min;94℃变性30s;65℃退火30s;72℃延伸1min,共30个循环,最后72℃延伸5min,4℃冷却终止反应;琼脂糖凝胶电泳;利用WD-9413B凝胶成像分析仪进行图像分析:用Gelpro32软件测量目的基因和内参的平均光密度值,并计算两者的比值,以该比值反应目的基因的mRNA表达水平。载玻片防脱片处理,切片常规脱蜡至水,按照试剂说明书的步骤进行操作;苏木素轻度复染,脱水,透明,封片;显微镜观察,拍照;采用BI2000医学图像分析系统进行图像分析,选取200倍图像,观察肺内支气管部位,细胞质呈棕黄色为TLR4阳性表达细胞,每张切片随机选取至少5个高倍视野进行积分光密度测定,取其平均值作为该切片的代表值。采用SPSS13.0统计软件处理,采用单因素方差分析,用LDS法进行均数两两比较,结果以ue0af±s表示。以P<0.05为差异有统计学意义。对大鼠肺组织tlr4mrna表达的影响在饲养、造模和治疗过程中各组大鼠均有死亡,每组取8只进行RT-PCR和免疫组化实验。见表2。与对照组相比,脾虚哮喘组大鼠肺组织中TLR4mRNA的表达显著升高(P<0.01),与脾虚哮喘组相比,脾虚哮喘治疗组大鼠肺组织中TLR4mRNA的表达显著降低(P<0.01)。见表3,图1。脾虚哮喘组大鼠肺组织切片免疫组化显示阳性细胞浆呈棕黄色,TLR4蛋白阳性主要表达于各级支气管上皮细胞、肺泡巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞及淋巴细胞等。与对照组相比,脾虚哮喘组大鼠肺组织中TLR4蛋白的表达显著升高(P<0.01),与脾虚哮喘组相比,脾虚哮喘治疗组大鼠肺组织中TLR4蛋白的表达显著降低(P<0.01)。tlr4影响呼吸道炎性及炎性哮喘是气道的慢性炎症性疾病,哮喘患者的气道内存在着不同程度的多种炎性细胞的浸润和炎性因子的聚集,经过一系列炎性反应,导致气道的炎性渗出、气道高反应性及气道的重构。气道高反应是哮喘的重要特征,而气道炎症是哮喘主要的病理变化。现在研究证明,在大鼠的肺组织中TLR4表达于胞浆,主要分布于气道上皮细胞、肺泡巨噬细胞和血管内皮细胞等。TLR4识别入侵的病原体,在介导炎症反应的信号转导中通过诱导多种细胞因子和化学因子的生成与释放,形成以中性粒细胞浸润、微血管内皮细胞损伤及蛋白液体渗漏为特征的炎症反应。TLR4还可介导肺部损伤的后期修复性炎症反应,引起并加重气道的改造与重构。因此,深入研究TLR4已成为近年来介导形成气道炎症反应的研究热点。哮喘在中医学属于“哮病”的范畴,脾虚为哮喘之宿根,脾虚则周身气机转输失常,影响肺之宣肃则致咳喘;脾虚则生气无源,卫外失固而易感外邪诱发哮喘,故认为脾虚是哮喘的关键,补脾益气方即所谓肺病不愈,求治于脾。通过补脾达到疗肺的目的。刘仁慧等实验研究表明,健脾益气可改善哮喘患者的过敏体质,增强机体免疫力及气道的防御能力,以消除气道炎症。哮喘的本质是气道的慢性炎症,脾虚能加重哮喘的炎性反应以及炎性细胞和介质的合成。本实验结果显示:HE染色观察,脾虚哮喘组肺组织和支气管上皮细胞损伤脱落严重,嗜酸性粒细胞等炎性细胞浸润和聚集增加;脾虚哮喘组大鼠TLR4mRNA和蛋白的表达较对照组均明显增加,说明脾虚可以通过TLR4信号转导的途径影响炎症细胞及因子的表达和释放,进而加重哮喘的气道炎症反应。本实验通过研究探索出补脾益气方对哮喘中TLR4介导的炎症反应的影响。选用补脾益气方作为处理因素,通过补脾肺之气,使身体产生抵御外邪之正气。实验结果显示:补脾益气方能够明显降低脾虚哮喘组大鼠肺组织中TLR4mRNA和蛋白的表达,说明补脾益气方主要通过影响TLR4的翻译进而调控炎症因子。本实验为临床治疗哮喘提供了一定的理论依据,也为临床防治哮喘提供新的办法,即通过抑制这条途径上的主要介质来防治哮喘,可以研发