火针对类风湿性关节炎大鼠血清il-1和nf-的影响

火针对类风湿性关节炎大鼠血清il-1和nf-的影响

类风湿性关节炎（ra）属于中医学的“麻痹综合征”范畴，是一种高度复杂的自身免疫性疾病。在RA的发病过程中,滑膜炎是最具特征性的病理改变,滑膜组织表现为增生性侵蚀性生长,导致关节侵蚀、功能障碍。近年来的大量临床及实验研究显示,采用多种针灸疗法,如电针、麦粒灸、火针、蜂针、针刀、穴位注射等治疗痹证均有较为满意的疗效。火针疗法具有温经散寒、祛风化湿、活血通络的功用。临床研究表明,火针能消除关节肿胀、疼痛,改善关节功能,在RA早期的炎性反应控制及预防关节损害方面疗效突出。本实验通过观察火针对RA大鼠足跖肿胀度、血清白介素(IL)-1和肿瘤坏死因子(TNF)-α的含量以及滑膜组织病变的影响,从现代医学的角度初步探讨火针治疗RA的作用机制,为火针治疗类风湿性关节炎的临床推广奠定理论基础。1材料和方法1.1动物在实验前的适应性饲养1周,土xk鄂5.7%雌性Wistar大鼠40只,体质量(200±20)g,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供[许可证号:SCXK(鄂)2010-0007]。动物在实验前适应性喂养1周,动物房温度、湿度分别维持在25℃、70%左右。随机分为正常组、模型组、火针组、甲氨蝶呤(MTX)组,每组10只。1.2仪器、检测方法完全弗氏佐剂F5881(美国Sigma公司);IL-1、TNF-α试剂盒(上海森雄公司);MTX(上海信宜药厂有限公司)。电子秤(杭州万特衡器有限公司);AL204-IC电子分析天平(上海精密仪器仪表有限公司);华佗牌火针(苏州医疗用品厂);大鼠足容积测定仪(自制);spectraMAX190全波长酶标仪(美国MolecularDevices);OLYMPUS-BX53正置荧光显微镜(日本奥林巴斯)。1.3皮肤消毒效果模型组、火针组、MTX组大鼠用5%水合氯醛(0.8mL/100g)腹腔麻醉,于右后足跖底部常规皮肤消毒后取3个点,用微量注射器皮内注射0.1mL完全弗氏佐剂。观察3d,以24h出现足部急性炎性反应肿胀,48h出现继发性全身多发性关节炎,表现为前肢或对侧肢体甚至耳、尾部红肿或炎性结节出现,提示造模成功。正常组处理方法与其它组相同,仅以生理盐水代替完全弗氏佐剂。1.4点刺“夹脊穴”的治疗造模后12d,将火针组大鼠固定,暴露背部及后肢,用直径0.5mm、长5cm的细火针烧红后迅速点刺“夹脊穴”8处(两侧夹脊穴“之”字型交替取穴)、“足三里”和“阿是穴”(关节红肿最严重处3穴),每次点刺深度为5mm,每3d治疗1次,共治疗8次,每7d予以蒸馏水空腹灌胃。MTX组大鼠以MTX按每周2.0mg/kg灌胃,每7d灌胃给药1次,共治疗4次,每3d固定1次,不针刺。1.5观察指标和测试方法1.5.1后足回血率在造模前及造模后12、19、26、33d检测大鼠右后足足跖肿胀度。用带刻度的10mL小试管装适量水,固定大鼠,将待测后肢(包括整个足掌),以胫骨下端内踝处为解剖标志点,伸入液面下,观察并记录水面上升数值。1.5.2血清tnf-和il-1的检测在造模后第33天治疗结束后,将各组大鼠用5%水合氯醛(0.8mL/100g)腹腔注射麻醉,抽取大鼠腹主动脉血2mL,静置30min后以3000r/min的速度离心5min后收集血清,于-20℃冷冻保存。采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测大鼠血清TNF-α和IL-1。检测前20min从冰箱取出样品静置,室温下融化。建立标准曲线后加样,每孔中加入血清100μL,封板置37℃恒温箱中120min;洗板5次后每孔加入第一抗体工作液50μL,在旋涡振荡器上混匀后封板置37℃恒温箱60min;洗板5次后每孔加入酶标抗体工作液100μL,混匀后封板置37℃恒温箱60min;洗板5次,每孔加入底物液100μL,混匀后封板置37℃恒温箱反应10min;每孔加入终止液50μL混匀,立即在450nm波长下测定吸光度值,通过标准曲线计算样品中TNF-α和IL-1的含量。1.5.3滑膜的固定和染色将处死的大鼠沿右侧后腿膝关节正中纵行切开皮肤,直至暴露出以膝关节为中心约3cm×3cm的区域。打开膝关节,由髌骨下极向下延续有一层平滑光亮的浅淡黄色的滑膜组织,用眼科剪紧贴关节面边缘将滑膜完整剪下,用眼科直镊夹起置于10%的甲醛中固定24h,室温保存。取固定好的滑膜组织,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切片,H-E常规染色后脱水、透明、封片。在光镜下观察滑膜染色结果。1.6统计学分析检测结果以均数±标准差表示,采用SPSS13.0统计软件包进行统计学分析,计量资料组间比较采用方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义的标准。2结果2.1各组大鼠足水肿度造模后大鼠足肿胀度均明显高于正常组(P<0.01);造模后19、26d火针组大鼠足肿胀度明显低于模型组和MTX组(P<0.01);造模后33dMTX组大鼠足肿胀度明显低于模型组(P<0.01)。说明MTX、火针均可使大鼠足肿胀度下降,但是火针早期疗效较MTX显著。2.2大鼠血清nf-、il-1和tnf-模型组大鼠血清TNF-α和IL-1含量均明显高于正常组(P<0.01);MTX组大鼠血清TNF-α含量明显低于模型组(P<0.01),IL-1含量明显低于模型组(P<0.05);火针组大鼠血清TNF-α和IL-1含量明显低于模型组(P<0.01),且明显低于MTX组(P<0.05)。说明MTX、火针均可使大鼠血清TNF-α和IL-1下降,且火针的疗效优于MTX。2.3各组滑膜细胞病变正常组:膝关节滑膜细胞排列均匀,无增生,滑膜内淋巴细胞、浆细胞浸润不明显;模型组:滑膜细胞增生,滑膜肥厚,可达10~12层,排列紊乱,滑膜内有大量炎性细胞浸润;MTX组:滑膜细胞增生仍较明显,可达6~8层,排列仍紊乱,滑膜内仍有许多炎性细胞浸润;火针组:滑膜细胞增生不明显,3~5层,滑膜内有少量炎性细胞浸润。3火针治疗的疗效RA活动期可有关节红肿热痛、僵硬、活动受限等,晚期可引起关节畸形和功能障碍,部分病人还可累及全身其它器官,是一种发病率、致残率高的自身免疫性疾病。治疗RA的目的在于缓解疼痛、延缓病情发展,保护关节功能。MTX是目前公认治疗RA的首选药物,通过细胞周期阻滞抑制RA滑膜细胞增殖,阻止滑膜组织对周围组织的侵蚀,从而起到治疗RA的作用。本实验将火针疗效与MTX对比更能体现火针的优势。本实验中,大鼠在完全弗氏佐剂的刺激下,足部肿胀,血清TNF-α和IL-1含量明显升高,滑膜细胞增生,炎性细胞浸润。给予MTX或火针治疗后足部肿胀度减轻,血清TNF-α和IL-1含量明显降低,滑膜细胞增生及炎性细胞浸润减少,这与文献报道中火针能促进炎性反应局部渗出物的吸收,减轻和消除关节肿胀,抑制病变的进展,改善关节功能是相吻合的。火针组疗效优于MTX组。从火针对大鼠足部肿胀度的疗效看,其好转是一个渐进的过程,在治疗1周后(即造模后19d)火针组疗效逐步显现,提示火针效应的发挥并不是即刻效应。与火针组相比MTX组的显效更加缓慢,直到治疗3周后才出现,表明火针对于下丘脑-垂体-肾上腺轴的激发作用快于MTX,火针能更快地调节机体内分泌系统。RA是一种伴有炎性细胞浸润和骨质侵蚀的滑膜组织增生性疾病。滑膜组织的增生、炎性反应和自身免疫反应3个病理生理过程相互作用、相互联系,共同推动病情的进展,细胞因子广泛参与这3个病理生理过程并起到了重要作用。其中IL-1和TNF-α是众多促炎性细胞因子中的关键因子,表现为生物协同作用。IL-1可诱导急性期反应,在活动性RA中激活血管内皮细胞,增强内皮细胞黏附分子的表达,在关节炎时血液中的白细胞与黏附分子相互作用而被汇集到关节内,加重免疫性炎性反应。淋巴细胞、单核细胞等炎性反应细胞的浸润是前期炎性反应过程的主要表现。IL-1升高,提示炎性反应细胞浸润、炎性反应启动。TNF-α主要由单核细胞和巨噬细胞产生,在RA的发病中其作用为:(1)致热原作用,激活B细胞、单核巨噬细胞、中性粒细胞、血管内皮细胞等介导免疫反应;(2)诱导软骨和成纤维细胞合成与分泌胶原酶、前列腺素等炎性介质,介导滑膜炎性反应和软骨破坏。故而降低TNF-α水平是治疗RA显效环节之一。本实验通过火针点刺“足三里”和“阿是穴”促进关节局部的血液循环,放松局部肌肉,减轻滑膜的炎性反应,消除疼痛;点刺“夹脊穴”和“足三里”增强机体免疫力,调节细胞因子TNF-α和IL-1的