基因工程原理beike

基因工程原理第一章基因与基因工程1.1基因的现代概念1903Sutton,Boveri遗传的染色体学说1909Johannsen基因1910Morgan基因学说1941Beadle,Tatum一基因一酶1944Avery,遗传物质DNA1953Watson,Crick双螺旋1973基因工程诞生（分子水平）跳跃基因：1956McClingtock；断裂基因：外显子，内含子；

重复基因：真核生物；重叠基因：原核生物；假基因：1977G.Jacq珠蛋白1.2基因工程的诞生理论基础：1.遗传的物质基础DNA2.基因的自我复制和传递（1953）3.遗传信息的流向及表达问题的阐明（1961操纵子；1966中心法则）技术基础：1.工具酶（1967连接酶；70内切酶）2.载体3.逆转录酶发现（70）中心法则的完善助产士1972，P.Berg,美，斯坦福大学DNA体外重组1973,S.Cohen诞生：19731.3基因工程研究内容基因工程：在体外将核酸分子插入病毒，质粒或其他的载体分子上，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞内，而能持续稳定的遗传。内容（步骤）1.分离目的DNA片段2.与载体相连成重组DNA分子3.重组DNA分子引入受体细胞4.扩增，获得大量细胞繁殖群体5.筛选具有重组DNA分子的细胞克隆6.目的基因实现功能蛋白的表达第二章基本技术凝胶电泳，核酸分子杂交，序列分析，细胞转化，DNA分子切割与连接等

2.1凝胶电泳1.种类：琼脂糖0.2-50kb；聚丙烯酰胺1-1000bp2.原理：电泳的迁移率，核酸的取决于大小与构型（共价闭合螺旋状环形DNA〉开环〉线形）3.E.B

2.2细胞转化存在问题：外源DNA片段难直接导入受体细胞即使进入无法复制诱导受体菌成感受态2.3核酸分子杂交1.种类：Southern,Northern2.原理：互补的DNA或RNA混合，同源区段退火形成双链结构3.步骤：核酸印迹转移，核酸杂交（Southern硝酸纤维素滤膜，尼龙膜；Northern叠氮化的活性滤膜）4.用途：亲缘关系，核酸片段中某一特定基因的位置2.4DNA序列分析Maxam,Gilbert化学裂解法；Sanger双脱氧链末端终止法Sanger双脱氧链末端终止法

原理：2`,3`-双脱氧核苷三磷酸参入寡核苷酸链的3`末端，无3`-OH末端。反应终止。Maxam,Gilbert化学裂解法原理：用化学试剂处理具末端放射性标记的DNA片段，造成碱基特异切割。第三章基因操作的工具酶限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶，修饰酶，核酸外切酶，单链核酸内切酶

3.1限制性核酸内切酶定义分类：Ⅰ，*Ⅱ，Ⅲ（*1970H.O.Smith,K.W.Wilcon从流感嗜血菌Rd株分离）命名：R.HindⅢⅡ型基本特征：特异识别序列， 断裂类型（粘性，平）影响活性因素：纯度，甲基化，分子结构，温度，缓冲液同尾酶，同裂酶3.2DNA连接酶（1967）作用机理：封闭双螺旋DNA上缺口类型：DNA连接酶, T4DNA连接酶DNA片段的连接：粘性末端平末端（1）T4DNA连接酶（2）同聚物加尾法：末端脱氧核苷酸转移酶3`-OH（3）衔接物连接法：10-12，酶识别位点（4）接头连接法：粘，平3.3DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ1957，美，Kornberg1.多功能5`-3`聚合酶；5`-3`外切酶；3`-5`外切酶2.DNA杂交探针的制备缺口转移法大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段（Klenow酶）1.活性5`-3`聚合酶；3`-5`外切酶2.用途修补3`隐蔽末端；标记DNA片段末端；CDNA克隆的第2链CDNA的合成；DNA测序T4DNA聚合酶5`-3`聚合酶；3`-5`外切酶逆转录酶1.活性RNA依赖的DNA聚合酶；DNA依赖的DNA聚合酶；外切酶活性3.4DNA和RNA的修饰酶末端脱氧核苷酸转移酶； T4多核苷酸激酶； 碱性磷酸酶末端脱氧核苷酸转移酶与同聚物加尾

T4多核苷酸激酶与DNA分子的5`末端的标记碱性磷酸酶与DNA脱磷酸作用第四章基因克隆载体质粒载体，<15kb噬菌体载体，15kbCosmid，31-45kb单链DNA噬菌体M13，1kb动物病毒4.1质粒载体天然质粒：F，R，Col天然质粒特性双链闭合环状DNA分子复制类型不亲和性质粒载体的选择质粒载体具备条件：自主复制；限制酶单一切割位点；筛选标记；小，多拷贝大肠杆菌质粒载体：PSC101，9.09kb；（1973）ColE1，6.3kb；pBR322，4.3kb4.2噬菌体载体噬菌体一般特性核酸，蛋白质外壳温和，烈性λ噬菌体载体(1974)1.λ噬菌体DNA分子，48502bp2.λ噬菌体载体的构建原理：删除多余限制位点e.g.5EcoRⅠ；步骤：类型：插入型：一个替换型：成对3.常用λ噬菌体载体凯伦噬菌体载体：1977F.R.Blattner等4.应用体外包装（5%-75%），23kb4.3柯斯质粒载体柯斯质粒：λ噬菌体cos位点+质粒复制子特点：具有λ噬菌体特性；质粒载体的特性；高容量应用：4.4单链DNA噬菌体载体M13噬菌体生物学特性M13噬菌体载体非必要区：IS类型：插入一个lac操纵子片段；在上一基础上再插入一多限制酶的人工接头应用：4.5真核细胞的克隆载体植物基因克隆的载体：Ti质粒Ti质粒的结构和特性环状，双链DNA，1.5-2×105；T-DNA动物基因克隆的载体：技术：电穿孔，显微注射，原生质体融合，病毒载体SV40病毒（猿猴空泡病毒40），5.2kbSV40病毒DNA，蛋白外壳2.SV40病毒载体取代型的重组病毒载体重组的病毒-质粒载体

4.6噬菌粒载体（phagemid）质粒+单链噬菌体载体；3000bp第五章基因分离与重组及重组体向宿主细胞的导入基因克隆的基本步骤：1.目的DNA片段的获得2与适当的载体体外连接3.重组体导入寄主细胞4.选择与鉴定重组体的克隆5.1目的基因的获得化学法，基因文库钓取，mRNA逆转录1.化学法合成 150-200bp，干扰素基因2.构建基因文库钓取目的基因 （1）基因文库： 载体：λ噬菌体25kb；质粒15kb；柯斯质粒45kb（2）适当的基因探针3.逆转录法

特异高度分化组织；总RNA5.2重组体的构建1.外源DNA片段定向插入载体分子2.非互补粘性末端DNA分子的连接 （1）接头 （2）衔接物 （3）同聚物加尾5.3重组体向宿主细胞的导入宿主细胞：能复制表达外源DNA导入途径：转化或转染；显微注射；电穿孔1.重组体DNA分子的转化或转染 关键：Cacl22.体外包装的λ噬菌体的转导（1）重组λ噬菌体DNA（2）体外包装（3）注入寄主细胞第六章重组体克隆的筛选与鉴定检测方法： 遗传检