第二十章 烟草特征呈味成分的鉴定及分析方法

第二十章烟草特征呈味成分的鉴定及分析方法前言

我今天要给大家讲课的内容不仅涉及烟草香味成分的分析，而且涉及天然及合成香料以及香精的分析。今天的内容主要是面上的，如果涉及较深入或具体的内容我们可以留待以后分出若干课题来共同探讨，例如涉及GC-MS测定方法、涉及LC-MS分析方法以及NMR、X-射线衍射等等，也可分别请国内外专家来讲。我今天讲的尽可能面上都讲到，达到抛砖引玉的作用及目的。关于香气成分的分析我想分成以下三个大方面给予介绍

取样

分离的方法

鉴定的方法一、取样取样是确保分析结果的准确性及代表性最关键步骤之一。在香味物质分析时，仔细地将所取样品与参照标准品的香气进行比较是必须的，还应经常注意可能出现的各种问题。香料取样存在的问题例子包括：（1）二相或多相：在桶里或其它容器中的水或固体物的存在。（2）不均匀性：例如常见的没药或乳香这样一类粗树胶，它们是由不规则的块状固体组成的。

（3）浸膏香脂则是一类粘滞的半固体的物料，它们的取样应予注意。取样方法可参见[Kolthoff,I.M.,andElving,P.J.,eds.(1978)的书“TreatiseonAnalyticalChemistry”Parti.Zeded.,Vol.IWiley,NewYork]或其它国内外有关书籍。

取样应根据研究目的、也应根据分析对象的状态加以考虑。例如：烟草烘丝过程中的香气损失或变化可考虑对气态的取样。二、分离方法

在许多情况下（包括浓的香精、香基、精油及化学品），对试样没有必要进行分离或浓缩就可以直接进行分析。而在更多的情况下，要对香气成分进行分析就必须从试样中分离出我们所要研究的组分。通常先做一些小试管量的试验或其它小试验有助于选择合适的分离技术。同时，在一些试验中，注意观察香气的持久性、稳定性、及挥发性和功能性的变化。这样分析工作者就可以初步决定对香气分析是按常规方法，还是应用比较特殊的方法。对方法的选择，主要考虑将要分析的范围，所希望得到的分析内容以及加香对象或基质、介质的特性。（一）蒸馏技术所有的蒸馏方法、目的均为使分析对象的挥发性组分与非挥发性组分或挥发性较低的组分分离开。与提取法相比，优点是：没有非挥发性成分存在，不会干扰其后的色谱分析；缺点是蒸馏后若得到的是稀水溶液，则需要增加一个分离步骤，把挥发物分离出来。（我们在同样条件下曾做过对比分析，其色谱峰形明显不同）。1.水蒸汽蒸馏可分为常压和减压两各种类型。基本原理类似于化学分析中烟碱分析中的水汽蒸馏。现设计有不同的小型装置2.分馏根据沸点不同，用经典填充柱和高回流比的分流操作，经常能够完成必要的分离。由于柱滞留容积相当大，在试样量较小时此法不宜使用。此法适合于对热稳定性强且有足够量的物质分离，例如可将30磅绿叶油分离成4个主要馏分，其中各个馏分再分别用不同方法分离处理，鉴定出香味成分。3.高真空蒸馏此方法适用于从非挥发油中分离出少量挥发物，也适用于分离食品或烟草等体系挥发性物质，所要达到的真空度要看分离对象中是否有水，当无水时，此法真空度可达10-3mmHg(0.133pa)或更低，此时是分子蒸馏，当有少量水存在时，可实现高真空蒸馏。此图是一种高真空蒸馏系统草图，此方法分离香味成分体系中不会产生新化合物。4.分子蒸馏所谓分子蒸馏，也就是在蒸馏中被蒸馏分子从液体表面蒸发到被冷凝下来的冷却表面之间的距离小于分子的“平均自由行程”的蒸馏。要实现分子蒸馏有两个条件：第一，蒸发面到冷却面之间尽可能有小的间距；第二，体系要有较低的压力（10-3mmHg柱，0.133Pa）。一般有两种蒸馏装置可进行分子蒸馏，一种是流动薄膜蒸馏锅，另一种是锅式蒸馏锅。前者适用于处理大量的分离对象（0.1-2L），后者适合于小量分离体系(0.01-0.1L)。(二)提取1.原理该方法原理是基于香味成分在溶剂相和被分离对象相态或溶剂相和蒸馏液之间分配系数的不同。该法最简单的例子就是用分液漏斗提取法。由于被分离的对象各不相同，所以提取装置及方法也不相同。2.溶剂的选择和回收率在分析工作中常用的溶剂及性质列表如下：含乙醇水溶液香料体系（例如香精）的提取，常选择能区别乙醇和其它低级醇的溶剂。有效的溶剂是极性较小的溶剂，如异戊烷、戊烷/二氯甲烷混合物、三氯氟甲烷等溶剂，尤其是三氯氟甲烷用于含醇量高的香精萃取是非常有效的，它几乎不提取醇类物质（甲、乙醇）。另外，已腈较适合于提取脂肪含量高的产品挥发性香味成分。对一个体系究竟选用何种溶剂进行提取原则上应把握以下几点：第一，对感兴趣的物质有较大的分配系数，（可根据相似相溶原理考虑）；第二，香味成分与溶剂物理性质上易于分开。极性大小例如极性小的用烷烃，极性大的用醚、醇类。3.

直接萃取技术固体样品分析的萃取可采用索氏提取器提取法液态样品提取最简单方法是分液漏斗中摇动、分层分离。但更多采取连续萃取的方法，这里有两种装置，一种用于分离比水重的溶剂提取，另一种用于比水轻的溶剂提取。4、同时蒸馏—萃取技术同时蒸馏萃取也称共蒸萃取（SDE）其方法及原理用图讲解。此法早期用于酒花、胡萝卜、钟椒、蕃茄、橄榄油、土豆条、花生、蘑菇和坚果的挥发性物质。现在用途越来越广泛，我们已用于烟草香味分析，优点是样品用量少，GC图形好，易定量化。缺点是含香物质可能长期受热化学成分变化。（1）

设备图（2）

原理（3）

优点、缺点5、

超临界CO2流提取技术。6、固相微萃取技术（SPME）固相微萃器是一种仿制注射装置，其注射头采用多孔高聚物阱的热解吸作用原理，对挥发性香味物质进行提取，然后进行鉴定。该方法目前已开始在卷烟香味成分分析中应用，适合于定性、定量不够准确。有人利用裂解装置与GC-MS或GC联接，在瞬间高温条件下，将挥发性成分蒸发出来，进入GC分离鉴定，或GC-MS分离鉴定。优点：快速，样品量少。缺点：在高温条件下某些物质可能发生化学变化或作用。7、闪蒸法8、选择萃取技术这种方法是兼有离析法和分离法的特征，下表为能有选择性萃取带有酸性或碱性物质成分的常用提取剂。10%Na2CO3羧酸5%NaOHKOH酚、内酯5%H2SO4碱性成分

例1：栀子花净油分析桅子花净油中分离碱类、酚类、酸类、内酯及一个中性成分。例2格蓬香脂油的分析格蓬香脂油中分离和鉴定了3个烷基吡嗪（0.1NHCl）和5个甲氧基烷基吡嗪（0.25NHCl）。例3烟草成分的酸、中、碱性成分分离B4F烤烟提酸物提取5%H2SO4水层有机层水层有机层(25类)NaOH水层有机层（有机酸）（三）气相分离技术1.

平衡液面上空间取样分离方法此方法是早期分析平衡气相的经典方法，其中吸气法和通气法要涉及用适当的方法进行收集，其收集方法有冷冻、吸附。直接取样吸气法通气法2.固体样品挥发物的直接收集该类方法一般采用将被分析对象（植物材料、商业产品等）在惰性气体流中加热，逸出的挥发性组分用多种方法收集及分析。它不同于液面平衡方法。例如：为测定烘丝中香气挥发情况变化，可采取下图方法分离烟丝N2heat冷阱1冷阱2活性碳等吸附3.

顶空分析技术顶空分析是一种分析气相物的好方法。现已发展起来有顶空分析仪。其原理是测定分析对象（液和固）在密闭体系中两相平衡时挥发性成分。下面一图是顶空分析仪下面一图是关系原理图（四）色谱分离方法

1.色谱分离方法香料工业也是应用气相色谱的先驱之一，至今在此行业仍发挥着重要作用。几乎所有现今流行的香味成分都用GC或GC的某种应用形式进行分析，GC除了广泛应用之外，它还是快速灵敏的分离方法，并且具有令人满意的定量准确度和高分辩力。这里不再讲GC的原理和仪器，现在发展已是相当高的自动化程度，HP6890Plus等仪器。这里要注意结合香味分析如何选择柱子问题。色谱柱是分离的关键因素之一，色谱柱现在主要有两种类型，一种是填充柱；另一种是毛细柱，作为柱子内的GC液相有两类在分析香味成分时得到公认。一类为标准极性液相Carbowax20m，属聚乙二醇类；另一类为标准非极性液相SE-30，一种甲基硅酮物质。(1)

填充柱典型的气相色谱填充柱是一根1/4”或1/8”OD×8或10的不锈钢管，里面装10%的SE-30或Carbowax20M的80-100目ChromosorbWHP载体。虽然不锈钢管对绝大数香味分析是合适的，但是现在有许多实验室改用玻璃管填定柱，后者一般表现较好的分离效果，并且很可能较少引起拖尾和分解。（2）毛细管柱毛细管（或开口管）柱的使用是为了提高分辩率，高分辩率对于组成香料的复杂混合物的分离是很重要的。早期由于不锈钢毛细金属表面有强的吸附和催化活性，使得许多香味成分分解或拖尾。因为玻璃毛细管柱有较大的惰性和较高的分离效率，所以现在实现上已取代了金属做的毛细管。现在又出现了用纯熔融二氧化硅做的柱子，在柱的惰性、效率和寿命等方面都比玻璃毛细管优越。（金属元素在毛细管柱上的存在多少是造成柱内液相和样品分解的原因。（3）柱的选择面对着一大批可用的GC柱型，我们工作中必须选择那些最适合于进行各种工作的柱子。下表所列为柱容量和要求的分离能力和几种典型的GC应用而进行推荐的主要标准。

1=小孔径（0.2-0.3mmID）玻璃或熔融SO2毛细管柱2=宽孔径（0.35-0.7mmID）玻璃毛细管3=填充柱（不锈钢或玻璃，10%固定相涂在担体上）上面的选择对于分析香味成分是非常有用的，具体选何种柱子，可根据分析对象情况，研究目的进行选择，对于柱子生产商提供的有关手册，也是分析工作者常用的工具书。（4）制备气相色谱法由于制备气相色谱法可以使用较大容量的柱子并且注射较多的试样，所以可用来纯化和收集个别组分或在较精细的分析前进行预分离。常用的有高效率和可靠性的填充柱是Carbwovx20M—一种极性柱子，也可用宽孔经玻璃毛细管柱，其由液相一般为高效的制备GC技术曾应用于烟草浓缩物的分析，由此分析出81种新的烟草成分并作出了鉴定（DemoleE.andBerthetD.Hellv.Chim.Acta55(6)，1972：1866）2.

柱色谱法（1）分级分离法湿法填柱，用溶剂洗脱，根据工作需要可进行分段洗脱，得到不同的馏分或组分，接下来再进行分析鉴定。例如，硅胶柱，乙醚在戊烷中含量逐渐增加，进行分级洗脱，可以分段地分离各类成分。（2）干柱色谱法在这一方法中，大多数组分不是通过柱洗脱，而是将填料移出按吸附层切割成段并用极性溶剂萃取。（3）银化色谱法该法是为了从不饱和化合物中分离出饱和化合物或不饱和物中分离几何何异构体。这种方法要求要么吸附剂中含有银盐要么洗脱剂中含有银盐。3.

薄层色谱法（TLC）薄层色谱法是快速、便宜及简单的技术，作为筛选工具特别有价值。一般制法及分析用途。4.

高性能液相色谱法（HPLC）对于分析分子量较大的物质、许多天然提取物中挥发性小的组分及热不稳定的物质，气相色谱是无能为力的，而HPLC却特别有效。HPLC具有定量、快速自动化等多方优点。（1）装置A.溶剂贮槽B.过滤器C.液体泵D.溶剂程序器E.压力表F.注射系统G.分离柱H.检测器I.记录仪J.组分收集器下图是液相色谱主要部分示意图泵的要求比较严格，因为要在高的工作压力下保持流动相有稳定的且无脉冲的流速。在现代仪器设备中常用的泵主要有两种类型：连续输液系统和活塞泵。连续输液系统装有一个柱塞杆，用准确调节好的驱使其在活塞筒中下行。使流动相在非常稳定的流速下输送，完全避免了脉冲。而活塞泵的脉冲在现代泵中已降至最小。柱子类型。液相色谱有四种基本类型，它们中每一种都需要有自己特定的柱料：（I）吸附色谱：填料为固体颗粒，例如：应用直径大约为10微米（μm）的硅胶或涂有一层硅胶层的玻璃珠（薄壳填料），这种玻璃珠的直径一般为几十微米（μ）这种柱子一般很少用梯度洗脱。（II）液液分配色谱：和气相色谱一样，填料是由固体载体和一层液体固定相组成。流动相是溶剂。固定相有可能被流动相溶解。因此，近年来最常用的固定相是以化学键与载体结合在一起的固定相。不然就在分离柱前加一根小的饱和柱，目的是使流动相为固定相所饱和。（III）离子交换色谱：阴离子或阴离子交换剂经常以化学键结合在支持剂，常用来作为离子化合物的分离。（IV）排阻色谱：填料的选用能按分子大小进行分离，也就是说对分子形状相似的化合物按分子量的大小不同加以分离。用这种柱子的分析方法常称筛析色谱法（SEC），这种方法在分析polymer方面常常有用。总之，对分析来讲，可以选用10-60米cm长，0.2-1.0cn直径，塔板数为100-10000块/米的柱子即可。注射系统和检测器

常用的检测器有两种，一类为通用检测器，对柱子流出液中任何一种化合物产生的或大或小的效应都能响应；另一种为特定检测器，它只对有限数目的化合物的物理性质所引起的效应产生响应。

在通用检测器中，最常用的是折射率（RI）检测器，它们原理是根据纯流动相的折射率连续测定洗脱液的折射率，有10-7RI单位的差别即可检出，通常相应物质的量为1μg数量级，但不特别灵敏。另一个是移动丝检测器，这种检测器利用一根金属丝将小量流出液移入溶剂蒸发室。除去溶剂后的组分转到副反应室，经过催化转化为甲烷，最后通过气相色谱那样的火焰电离散检测器加以检测。

在特定检测器一类中，UV检测器为常用的一类。最简单的检测器波长定在254nm处，较先进的其波长可在200-700nm之间调节；对有紫外吸收的化合物，灵敏度较高，例如对ε=104的化合物，1μg的量就检出。该类检测器中，其它的检测器还有荧光检测器，质谱检测器（LC/MSD法）。（2）应用例子（I）烟气中稠环芳烃测定（II）分析银白金合欢净油中的二个试样（III）其它方面：氨基酸、蛋白质、肽、分子量较大的色素。烟气中稠环芳烃测定

分析银白金合欢净油中

的二个试样

三

鉴定技术（一）GC的鉴定方法1.保留指数我们知道，香味成分的分析具有较复杂性质，所以，通常采用程序升温气相色谱进行分析，为了准确比较保留指数，有必要把原先的等温保留指数体系（Kovats,1958）推广应用到程序升温程序中（VandenDollandKrat,1963）。在香味分析中广泛使用的保留指数是根据是VandenDoll及Krat修改的在两个标准物之间的线性内插法。使用的标准物是直键的脂肪酸乙酯，保留指数为IE。式中：n=作为参考酯的脂肪酸部分碳数i=两个后续的参考酯之间碳数的增量t=各个峰的保留时间下图表示典型的保留指数测定，用一系列乙酯作单一的组分，IE用下面方程式来计算。

程序升温的线性指数体系的准确度和重复性虽不像等温体系那样好，但作为一种鉴定工具是毫无疑问的。分析作者可查阅有关香味成分的Kovats指数和色谱数据正确是相当有用的。2、GC方法应用（二）GC-MS法该法原理是先用气相色谱分离，后用MS检测器检测。该法鉴定是采用MS鉴定法。然而，即使是使用GC/MS，常常也需要进行复杂混合物的分组，因为痕量化合物需要进行浓缩并要与主要的干扰化合物分离，另外还需在两个有不同固定相的柱子上进行分离，不然就会得到混合图谱，不可能有满意的解析。（1）GC-MS法的工作原理先看图4-5气相色谱—质谱联用框图再看分子分离器工作原理图4-6

（2）方法和应用关于GC-MS在香气研究中的应用有两种不同的目的：第一，研究者一般可能对产品中些对产品香气有贡献的化合物的结构鉴定感兴趣；第二，研究者可能要测定并证明一个特定的已确定了的化合物或一组化合物的结构。由于计算机及标准质谱图在GC-MS分析方法中的应用，使得该法是一种较为方便、快捷分析香味成的方法。GC-MS的分析结果一个是总离子流图，另一个是质谱图分别存于计算机中，通过计算机的操作就可以得分析判别的结果，例如有人分析茉莉精油，从计算机上查离子流图共有175种以上成分，对每个成分均可找出其质谱图，例如83号峰，经与电脑数据库比较可以确定该物质为顺式茉莉酮。这样的例子很多，关键是侧重何类成分，选用何种分离方法及柱子，预处理如何等。（三）GC-FTIR法红外吸收光谱测定法得到广泛应用是因为它有如下功能：（1）它是