广玉兰开花动态及花粉活力和头骨可授性研究

广玉兰开花动态及花粉活力和头骨可授性研究

雌性异成熟（也称为早花）是指同一植物的雌雄在时间和空间上的分离，是动物和风食传播的普遍现象。由于雌雄异熟直接影响植物有性生殖,引发了国内外学者的广泛研究。目前,在木兰科(Magnoliaceae)、胡桃科(Juglandaceae)、腊梅科(Calycanthaceae)、毛茛科(Ranunculaceae)、木犀科(Oleaceae)、卫矛科(Celastraceae)等多个科属的植物中皆发现雌雄异熟现象。雌雄异熟常被看做是避免自交的机制,然而很多雌雄异熟的植物本身是完全自交不亲和的,它们避免自交并不需要雌雄异熟机制,所以Lloyd等又提出雌雄异熟的作用是避免花粉———雌蕊功能干扰。对于雌雄异熟的机制和意义,仍未有定论。广玉兰(Magnoliagrandiflora),别名荷花玉兰,木兰科木兰属木兰亚属,常绿乔木,花大,白色,状如荷花,芳香,原产北美东南部,在我国长江流域以南各城市均有栽培。在绿化观赏、用材、医药、化工、科研等方面皆有很高的价值。目前,关于广玉兰的研究国内主要集中在育种和栽培繁育技术、形态发育、细胞学、组织培养、化学物质的提取和应用、景观研究、分子生物学等方面;国外主要集中在化学成分、生态环境价值、珠被发育等方面,对于生殖生物学的研究较少。广玉兰的雌性先熟及二次开合现象已有报道,Allain的研究主要关注UV反射率、柱头可授性等花部特征变化与虫媒传粉间的相互作用;指出花朵在第1天开放时处于雌性阶段,但未界定第2次开放后的各阶段;涉及开花进程中一个阶段的花粉活力测定,未与雌雄异熟现象相关联解释其地机制及作用;仅研究广玉兰的生殖特性,未与其他木兰科植物生殖特性对比。本文主要研究了广玉兰开花各阶段花粉活力、柱头可授性、二次开合及雌雄异熟现象,在本课题组多年对木兰属玉兰亚属的白玉兰(Magnoliadenudata)生殖生物学研究的基础上,找出广玉兰与白玉兰生殖特性上的差异,从繁育机制角度分析木兰属内木兰亚属与玉兰亚属在进化上的关系。1材料和方法1.1树体及生长结果树花粉及柱头材料取自三峡大学校园内人工栽培的广玉兰,树高5~10m,胸径10~30cm。于2009年5—6月,2010年5—6月广玉兰盛花期,定点、定时观察并记录开花物候及单花开花动态变化。1.2学习方法1.2.1花粉的散出及测定收集广玉兰花期各阶段花粉,用于花粉活力测定。对于未自然开裂的雄蕊,采用室温风干、37~38℃下烘干及直接挑出花粉3种方法处理,使花粉提前散出。参考文献的方法配制MTT(thiazolylblue)溶液。在玻片上加1~2滴MTT溶液,撒上少量花粉,放置10min后在OlympusBX51显微镜下观察。凡被染成紫色至黑色的花粉,其生活力较强,紫红色次之,无色或仍为花粉原本色为不具活力的花粉。1.2.2实验方法生物清析法1)压片法。在广玉兰开花前去雄、套袋,分为4组分别在开花第1天、第2天进行异株异花及同株异花授粉。授粉后1、3及24h时取下柱头,用FAA固定液(V(70%乙醇)∶V(甲醛)∶V(冰醋酸)=18∶1∶1)固定。24h后取出柱头,在OlympusSZX10体视显微镜下切薄,10%无水亚硫酸钠水浴软化,蒸馏水清洗3次。苯胺蓝(anilineblue)避光染色5~10min,压片,OlympusBX51正置荧光显微镜紫外光下观察花粉萌发并拍照。2)MTT法。广玉兰开花后每4h采柱头3个,参照文献的方法,吸取10~20μLMTT溶液滴加于柱头上,10~15min后体视显微镜下观察颜色变化。若柱头表面呈深紫色,表示柱头活力较强,具有可授性,记做+++;呈浅紫色至紫色,表示柱头具有一定活力及可授性,记做++;仅部分位置呈浅紫色,表示柱头活力较弱,记做+;不被染色,表示柱头无活力,记做-。1.2.3花粉管萌发试验广玉兰开花前套袋,并分为两组。第1组在开花第2天,以花内散出花粉进行人工授粉;第2组在开花第1天上午取下雄蕊,37~38℃烘干使雄蕊提前散粉,当天将所得花粉回授于该花柱头。取第2组自花授粉柱头固定,压片检测花粉管萌发情况。果实成熟后,统计各组的座果率及结籽率。2结果与分析2.1广玉兰单花开花特征据观察,广玉兰为两性花,虫媒植物,花后于叶开放,群体花期从5月中旬开始持续至7月上旬,5月下旬—6月上旬为盛花期。在单花水平上持续5~6d,其中从花被片张开到雄蕊掉落约2d,花被片凋落约3~4d。遇到阴雨天时,该进程放缓。将花蕾发育过程人为分为4个阶段:1)双苞花蕾阶段:具双层苞片,外苞片开裂后被顶起,随后干缩脱落(图1a);2)单苞花蕾阶段:外层苞片已脱落,仅具内层苞片(图1b),柱头青色,向内紧贴雌蕊群柱,开花前4~7d苞片开裂,柱头开始外展;3)青蕾阶段:开花前2~3d苞片全脱落,露出青色花被片(图1c),柱头青白色,向外向下卷曲;4)青丝白蕾阶段,花被片开始松动,颜色由青变白、略带青丝(图1d),次日开放,柱头白色,向外向下卷曲。观察中发现,广玉兰单花开花过程具有二次开合现象,先后经历:1)初次开放阶段:第1天08:30—16:30间花朵初次绽放,12:00—14:00间花被片张开角度最大,约60°(图2a)。柱头向外向下卷曲(≤360°),表面具白色突起及黏液,雄蕊群紧贴雌蕊群基部(图2b)。2)闭合阶段:16:30—17:30间花被片开始闭合,19:00后花被片内轮近闭合,仅下部分离,中轮顶部靠拢,外轮张开角度≤30°(图2c)。柱头向外向下卷曲(360°~720°),表面具淡黄色突起及大量黏液;雄蕊群贴雌蕊群基部,花药不开裂(图2d)。3)二次开放阶段:第2天08:30—09:00间花朵再次绽放,花被片张开角度最大达90°。花药由外轮向内轮依次开裂散粉,雄蕊群逐渐外展并开始掉落;柱头向外向下卷曲(90°~360°),前期黄色,表面仍具突起和黏液(图2e),后期深褐色,表面突起萎缩,无黏液(图2f)。4)衰败阶段:从开花第3天起花朵逐渐凋零,花被片逐渐褐化、凋落(图2g)。柱头干缩,向外展,顶端略卷曲,表面近黑色,无黏液,雄蕊几乎全掉落(图2h)。开花过程遇到雨天时,花被片内轮顶部近闭合,中轮顶部稍向内靠合(图2g),对雌蕊群起遮挡保护作用,防止雨水过度冲刷柱头以减少花粉流失,保障受精。从雌雄性征表达的时间及次序上看,从青蕾到闭合阶段,雌蕊柱头皆具活力,雄性性征未表达,归为雌性表达阶段;二次开放阶段前期,花药开始开裂散粉,柱头仍具部分活力,雌雄性征在表达时间上有所重叠,归为雌雄性征同期表达阶段;二次开放阶段后期雌蕊柱头已失活,仅为雄性表达阶段。从雌性表达到雌雄性征同期表达阶段,柱头发生4方面变化:1)柱头表面的毛状突起由明显突起逐渐萎缩;2)颜色由白色逐渐褐化为深褐色;3)黏液分泌量由少逐渐增多,约在16:00—19:30间达到最大量,之后逐渐减少;4)柱头由外展到向外向下卷曲,卷曲度先增大、后减小到仅顶部略有卷曲的外展状态。雌性性征表达早且持续时间长,从开花前约1~3d持续至开花后24~26h,如遇阴雨天可能有所延长;雄性特征在开花约24~25h后表达,如遇阴雨天可能推迟至26~30h,表达时间持续约4~8h。广玉兰雌性先熟现象明显。从植株水平看,同一植株内不同花朵的成熟进度各不相同,可归为异步雌雄异熟。2.2定值准确性原则室温风干散粉、37~38℃下烘干散粉及直接挑出花粉的活力均值分别为87.06%、86.67%和86.98%。3种方法皆可使花粉提前散出,并保证较强的花粉活力。在后续测定中采用直接挑出花粉法处理未开裂雄蕊。该法无需等待,可保证花粉活力测定值的实效性和准确性。从图3中可以看出,随时间的推移花粉活力逐渐减弱。开花第1天及第2天的花粉活力均在80%以上,可收集作为人工授粉的花粉源。其中,初次开放阶段花粉活力最强,均值为92.48%,是花粉的最佳活力阶段。随后对该阶段花粉进行蔗糖溶液(10%蔗糖+0.01%硼酸)培养,3h后萌发率约为81%。表明广玉兰雌性表达阶段花粉虽未散出,但已具萌发力。通过对49株广玉兰花粉的观察测定发现:不同的广玉兰植株间新鲜花粉活力差异较大。依花粉活力范围分为3组,各项特征详见表1。通过对比发现,第1、2组植株花粉活力较强,其花粉量相对大,相对湿度略大,可聚集成小团块状,花粉块颜色相对深;而第3组植株花粉活力较弱,花粉量小,花粉较干,呈干粉或长条状,花粉块颜色相对浅。这些形态特征可以作为初步判断花粉活力的参考。2.3初始开放阶段高足低小细胞可授性检测通过表2中MTT法测活结果发现,广玉兰在开花前1~3d已具活力。花开后,雌性表达阶段柱头活力较强,可授性持续约24~26h。进入雌雄性征同期表达阶段后,柱头活力明显降低,可授性弱。衰败阶段柱头已失活,不具可授性。2010年经人工授粉所得的39个果实中,在雌性表达阶段成功授粉发育出的果实占总数97.44%,其中初次开放和闭合阶段分别占总数的56.41%和41.03%,而在雌雄性征同期表达阶段的只占2.56%。由此看出,初次开放阶段是广玉兰柱头最佳可授期,也是人工授粉的最佳时期,此点通过柱头压片观察结果也可证明:异交授粉时处在初次开放阶段的柱头中,授粉24h后花粉管已延伸至花柱道底部,花粉管生长速度快于处在雌雄性征同期表达阶段的柱头。通过进一步对柱头压片观察发现,同株异花、自花、异株异花花粉皆可在柱头上萌发出花粉管,花粉管可生长至花柱道内,聚集成束并延伸至花柱道底部(图4),说明广玉兰的柱头对3种授粉方式皆具可授性。其中,异株异花花粉萌发最快,在授粉1h后已检测到萌发,同株异花、自花的花粉萌发时间较异株异花长,在授粉3h后检测到萌发。自花授粉的第2组花粉萌发率及花粉管的生长速度也明显低于另两种花粉,说明柱头对自花授粉的可授性明显低于异株异花及同株异花。人工自花授粉第1组的139朵花中最终形成果实1个,但未形成种子,座果率仅为0.72%,表明二次开放阶段柱头对自花授粉的可授性很弱。第2组的8朵花中最终形成果实1个,座果率为12.5%,该果实的结籽率为20.9%,说明初次开放阶段柱头对自花授粉具可授性,可成功自花授粉。综合以上实验结果,广玉兰柱头可授性可由开花前约1~3d持续至开花后24~26h,初次开放阶段为柱头最佳可授期,对异株异花、同株异花及自花授粉皆具可授性。结合形态特征,具有可授性的柱头向外向下弯曲,表面有浅色的毛状突起及明显的黏液;无可授性的柱头向外展,仅顶端略卷曲,褐化并萎缩,无黏液。初次开放阶段内,自花花粉在柱头上可正常萌发,花粉管可伸入花柱道延伸至柱头底部,在柱头表面及花柱道内不发生自交不亲和现象,且自花授粉可座果并结籽,说明广玉兰存在自交亲和的潜在可能。但在胚囊、胚胎形成及发育的各阶段是否发生自交不亲和及近交衰退现象,则需进一步深入研究。3结论和讨论3.1次愈合现象的生物学意义本研究结果中,具活力的柱头形态与王亚玲等人总结出的木兰科植物柱头活力特征一致,但失活柱头的形态特征与柱头失活后紧贴雌蕊群柱这一描述不同。广玉兰柱头失活后仍向外展,仅顶端略卷曲(图2h)。此现象与白玉兰柱头失活后紧贴雌蕊群柱明显不同,是广玉兰与白玉兰的生殖特性差异之一。观察发现广玉兰具有二次开合现象,此现象也存在于玉兰亚属的白玉兰中,但对雌雄性征表达的分离效果与广玉兰有所不同。玉兰亚属的白玉兰在初次开放时是雌性阶段,花被片闭合后,柱头几乎不具可授性,第2次开放后柱头完全失活,雄性特征尚未表达,在开花32~36h后花药开裂散粉,其雌性阶段与雄性阶段的表达时间间隔36h;结合开花生热效应,提出二次开合现象的生物学意义为:第1次开放,花被片张开花香可吸引昆虫来访,使处在最佳可授期的柱头充分接受外界花粉,花被片闭合形成温暖小室,促进已接受的花粉在柱头上萌发,并为昆虫提供休憩地,再次开放,大面积接受阳光促进散粉,昆虫携带花粉飞出,利于花粉传播。木兰亚属的广玉兰,在初次开放及闭合阶段仅雌性特征表达,第2次开放后,在进入仅雄性特征表达的阶段前,要经历一个短暂的雌雄特征同期表达的阶段,在此阶段花药开裂,花粉散出,雌蕊柱头仍存在一定的可授性。结合形态和授粉等方面的研究,二次开合现象对广玉兰授粉主要起以下作用:初次开放时,与雌性先熟机制相互作用,有利于雌性表达阶段的柱头更好地接受异花花粉;傍晚花被片闭合,利于夜晚花内保温保湿,促进已接受的花粉在柱头上萌发以及自花花药成熟开裂;再次开放时,花粉散出利于传播,雌雄特征的同期表达可引发自然开花过程中的自花授粉,从形态表达上为自交的发生提供可能。木兰属两植物二次开合现象共同的特征是:开花第1天清晨花被片初次绽放,傍晚时花被片几乎全闭合,直到第2天清晨,花被片再次绽放,此后不再闭合。在自然开花过程中,白玉兰二次开合的时间自然地将雌性阶段同雄性阶段分隔开,雌雄性征的表达在时间上有36h的间隔,无重叠,从形态表达上不支持自交;而广玉兰的二次开合现象并未完全将雌性阶段与雄性阶段分隔开,中间存在雌雄性征同期表达的阶段,从形态表达上支持自交。雌性性征表达与雄性性征表达在时间上是否发生重叠,在形态表达上是否支持自交,是白玉兰与广玉兰在生殖特征表达上的一个主要差异。这可能也是玉兰亚属与木兰亚属在生殖特性上的一个重要区别,尚需对两亚属中更多代表种进行深入研究来证实。3.2白玉兰与广玉兰的自交不亲和性广玉兰初次开放阶段,自花花粉在柱头表面及花柱道内不发生自交不亲和现象,且自花授粉能座果并结籽,表明广玉兰存在自交亲和的潜在可能性。这与玉兰亚属的白玉兰明显不同。白玉兰异花花粉可在柱头上萌发,花粉管可深入花柱道引导组织内,暂未发现自花花粉在柱头上的萌发。异株异花授粉可座果并结籽,同株异花授粉胚珠后期败育,自花授粉不座果,说明白玉兰为严格意义的异株异花授粉,同株异花授粉胚珠败育为自交不亲和的滞后表现,即合子后自交不亲和。木兰亚属的广玉兰异花及自花花粉皆可在柱头上萌发,花粉管可深入花柱道引导组织内。异株异花、同株异花及自花授粉皆可座果并结籽,说明广玉兰非严格意义上的异花授粉,存在广义自花(同株异花)授粉,和狭义自花授粉。柱头表面及花柱道内不出现自交不亲和现象,广玉兰存在自交亲和的潜在可能。能否发生自交、自交是否亲和,是白玉兰与广玉兰重要的生殖特性差异。从交配系统上看,广玉兰属于异交自交混合型,而白玉兰是以异交为主型。目前,多数观点认为自交来源于异交,Takeba